[发明专利]一种基于RPA-LF对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法

说明书

本发明涉及病原菌检测技术领域，公开了一种基于RPA‑LF对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法，其特点是：以蜡样芽孢杆菌保守毒力基因Nhe为靶序列设计引物和探针，其上游引物5´‑CTAGTTATGAGACATGGTTAAAATCCACAACGGC‑3´，下游引物：5´‑Biton‑CCCAAAGTCAAGCTGAAGAGGACA TTGATCTGCC‑3´在此基础上将RPA技术和LF技术相结合，构建了RPA‑LF现场快速检测蜡样芽孢杆菌的方法，该方法不需要借助实验室的仪器设施，不依赖高素质技术人员，养殖户人员在养殖场内即可通过观察显色反应完成蜡样芽孢杆菌的检测，从而为防治蜡样杆菌病，特别是防止蜡样杆菌对养牛业的危害提供了条件。

技术领域

本发明涉及食品安全和家畜养殖领域，尤其涉及一种基于RPA-LF对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法，也是一种RPA-LF在蜡样芽孢杆菌检测当中的应用。

背景技术

蜡样芽孢杆菌(Bacillus Cereus.BC)是芽孢杆菌属的一种成短链或长链的革兰阳性杆菌，存在于土壤、灰尘、污水、饲料、植物及各类生熟食品中，对高温、紫外线、电磁辐射和有害化学物质刺激等条件具有较强的抵抗力。该菌以引起人食物中毒最为常见，并且除感染人以外，还可引起奶牛乳房炎和子宫内膜炎、犬猫腹泻和罗非鱼死亡等，给食品安全和养殖业发展带来严重危害。

我国国家标准GB 4789.14-2014规定蜡样芽孢杆菌主要靠传统的培养方法进行检测，是将送检的样品增菌后进行分离培养，随后对分离培养的可疑菌株进行形态学和生化鉴定，再对鉴定结果进行综合评价，确定可疑菌株是否为蜡样芽孢杆菌。该方法检测周期长，过程繁琐，对工作人员实验技能要求高，并且只能在实验室操作无法在现场进行检测，因此，不利于蜡样芽孢杆菌的快速检验，对于经济落后的地区，仍然不能满足其对于蜡样芽孢杆菌的检测需求。

重组酶聚合酶扩增技术（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）是一种新型的恒温扩增技术，该技术主要依赖重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换DNA聚合酶这三种物质，即可在恒温条件下实现核酸的指数倍扩增，从而形成了反应灵敏快速的RPA检测方法。2014年，RPA技术用于侧流层析（Lateral Flow，LF）检测，建立了RPA-LF体系。该体系经过短时间的恒温扩增反应后，肉眼即可观察检测结果，无须贵重仪器，操作简单，适合现场快速检测。

可是，由于该技术的实施需要对被测微生物设计特定的引物和探针，并且采用一系列特定的方法及技术参数，难度很大。因而，目前还没有看到RPA-LF用于蜡样芽孢杆菌，特别是牛致病性蜡样芽孢杆菌检测的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种能对蜡样芽孢杆菌进行实地快速检测，且操作简单，成本低廉的快速检测方法。

为了上述目的，本发明采用了如下技术方案：

提供一种基于RPA-LF对蜡样芽孢杆菌的快速检测方法，其特点是：以蜡样芽孢杆菌保守毒力基因Nhe为靶序列设计引物和探针：引物长度达到30~35 bp，GC含量占比40 %~60 %，引物内部不含重复序列，扩增片段长度不超500 bp，下游引物的5´末端标记生物素；探针长度至少达到42 bp，5´末端用荧光基团（FAM）进行标记，3´末端引入中断聚合酶扩增反应基团（3C-spacer）进行末端封闭，在探针中间引入THF，即无嘌呤无嘧啶位点(AP位点)，AP位点前至少要保留25 bp的碱基，AP位点之后至少有15bp的碱基。

所述引物扩增段长度为100~200 bp。

所述引物和探针设计为：

（1）引物：

上游引物：5´- CTAGTTATGAGACATGGTTAAAATCCACAACGGC -3´

下游引物：5´- Biton- CCCAAAGTCAAGCTGAAGAGGACATTGATCTGCC-3´

（2）探针：