[发明专利]腺胃坏死病毒实时荧光定量PCR检测试剂及应用

说明书

本发明公开了一种用于检测腺胃坏死病毒的引物对，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了一种腺胃坏死病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，包括所述的引物对。本发明还公开了一种腺胃坏死病毒的非诊断目的的检测方法。结果证实该引物对和对应的方法可以特异性检测到样品中的CPNV，较传统检测方法既可提高检测敏感性，又可做到定量分析的效果，本发明的方法尤其适用于检测来源于鸡的腺胃坏死病毒。本研究所建立的腺胃坏死病毒实时荧光定量PCR检测方法可填补CPNV的检测方面的空白，为鸡传染性病毒性腺胃炎的精准防控提供极其重要的技术支撑。

技术领域

本发明涉及生物基因工程技术领域，特别是涉及腺胃坏死病毒实时荧光定量PCR检测试剂及应用。

背景技术

鸡传染性病毒性腺胃炎(Transmissible viral proventriculitis,TVP)是一种由病毒引起的慢性消耗性消化道疾病，其可导致典型腺胃炎症状。该病多发于雏鸡，以发育不良、生长迟缓、粪便过料为主要特征。鸡群一旦发病，发病初期表现为缩头垂尾、羽毛蓬松、精神沉郁、挑食甩料；中后期，病鸡体型消瘦明显、腹泻、所排粪便中掺杂未消化的饲料；发病严重的鸡则会出现全身苍白，最终衰竭而亡。剖检可见腺胃肿大如球形，呈乳白色，触摸坚硬，腺胃壁水肿、增厚，腺胃乳头肿胀、出血、溃疡等病理变化，病理切片可见大量炎性细胞浸润腺胃组织、导管上皮细胞增生变性、抗氧化细胞坏死等病理变化。

近年来研究发现，腺胃坏死病毒(Chicken proventricular necrosis virus，CPNV)属于双链RNA病毒科、Birnacirus病毒属，与传染性病毒性腺胃炎密切相关，并推测CPNV是引起TVP的最主要病原，然而目前对于CPNV的检测尚无标准化、精准化方案。

发明内容

基于此，有必要提供一种特异性高、灵敏度强的腺胃坏死病毒实时荧光定量PCR检测试剂及应用。

用于检测腺胃坏死病毒的引物对，其序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.15所示。

一种腺胃坏死病毒检测试剂盒，包括所述的引物对。

在其中一些实施例中，所述腺胃坏死病毒检测试剂盒还包括dNTPs、Mg²⁺、双链DNA结合荧光染料、DNA聚合酶、腺胃坏死病毒标准品以及水。

在其中一些实施例中，所述双链DNA结合荧光染料选自溴化乙锭、SYBR Green、PicoGreen中的任一种。

在其中一些实施例中，所述腺胃坏死病毒标准品为含腺胃坏死病毒的质粒。

在其中一些实施例中，所述腺胃坏死病毒检测试剂盒还包括反转录酶和反转录引物。

一种腺胃坏死病毒的非诊断目的检测方法，包括以下步骤：

a、以已知浓度的含腺胃坏死病毒的质粒为模板、以双链DNA结合荧光染料以及SEQID NO.6和SEQ ID NO.15为引物对进行实时荧光定量PCR反应，建立标准曲线；

b、在与步骤a相同的条件下对待测样本进行实时荧光定量PCR，并根据所述标准曲线确定所述待测样本中的腺胃坏死病毒的拷贝数。

在其中一些实施例中，所述实时荧光定量PCR反应的退火温度为56℃～60℃，循环数为38～42。

在其中一些实施例中，还包括在38～42个循环之后，按照下述反应条件进行反应以得到熔解曲线的步骤：先升至96℃～95℃，后降到67℃～63℃，再升至96℃～95℃，每0.5℃读板一次。

在其中一些实施例中，所述实时荧光定量PCR的反应体系为：10μL的实时荧光定量PCR的反应体系中，加入SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.15所示引物各0.5μL，质粒模板或待测样本0.5μL。