[发明专利]用于检测玉米细菌性枯萎病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

本发明提供用于检测玉米细菌性枯萎病菌的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：上游引物F：5'‑AACACATGCAAGTCGGACGGTA‑3'；下游引物R：5'‑CCCGCCTACTAGCTAATCCCATC‑3'；所述探针序列为：5'‑CCCGTCCGCCACTCGTCACC‑3'。本发明还提供相应的实时荧光定量PCR试剂盒。本发明的试剂盒对玉米细菌性枯萎菌具有较高的特异性，能有效地将其与玉米其他的病菌害区分开来；通过荧光探针的实时荧光定量PCR反应，应用一步荧光法检测样品中玉米细菌性枯萎菌，其具有较高的灵敏度和特异性。

技术领域

本发明涉及用于检测玉米细菌性枯萎病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

玉米细菌性枯萎病(Pantoeastewartiisubsp.stewartii)是一种可造成玉米矮缩和枯萎的维管束毁灭性细菌，导管里充满黄亮色细菌粘液，病株的横切面上可以看到渗出的粘液，玉米的各个生长阶段都能被玉米细菌性枯萎病菌的侵染，典型的症状是矮缩和枯萎。主要为害甜玉米，在严重时可造成全田颗粒无收，因此，它被我国列为进境一类有害生物禁止从疫区进口玉米种子。病菌通过病种子进行远距离传播，病区通过玉米叶甲和杂草寄主传播并越冬。

目前针对其检测方法主要有分离培养法、表型症状鉴定和普通PCR检测等方法。分离培养法检测方法操作复杂、耗时较长且检出效率低，不适合快速检测；田间种植表型症状鉴定结果不稳定、耗时长等；普通PCR技术灵敏度低，且无法实时鉴测PCR过程。随着分子生物学技术的不断发展，实时荧光定量PCR目前已广泛应用于菌种的检测，其与常规的分离培养和常规PCR技术相比，具有耗时短、操作简便、特异性好，且结果可直接观察，能有效避免交叉污染等优点。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了用于检测玉米细菌性枯萎病菌的特异性引物和探针及实时荧光定量PCR检测试剂盒，本发明基于荧光定量PCR检测技术，通过设计高灵敏度、特异性的荧光探针、上游引物和下游引物，可选择性地扩增玉米细菌性枯萎病菌，从而将其与常见的玉米病害其它菌种分开。该检测方法具有较高的特异性、灵敏性和操作便利性等优点，弥补了常规培养检测方法检测周期长，检测种类比较局限的缺点。

本发明提供用于检测玉米细菌性枯萎病菌的特异性引物和探针，所述特异性引物为下述序列或为下述序列的互补链序列：

上游引物F：5'-AACACATGCAAGTCGGACGGTA-3'；

下游引物R：5'-CCCGCCTACTAGCTAATCCCATC-3'；

所述探针序列为：5'-CCCGTCCGCCACTCGTCACC-3'。

作为优选，所述探针中5’端标记的荧光报告基团为FAM；3’端标记的荧光淬灭基团为TAMRA。

作为优选，所述上游引物和所述下游引物为向5’端和3’端方向延伸一至数个碱基或删减一至数个碱基得到的序列。

本发明提供一种用于检测玉米细菌性枯萎病菌的实时荧光定量PCR试剂盒，所述实时荧光定量PCR试剂盒包括上述的特异性引物和探针。

作为优选，在25ul PCR反应体系中，所述上游引物的用量为0.4ul，所述下游引物的用量为0.4ul，所述探针的用量为0.2ul。

作为优选，所述实时荧光定量PCR试剂盒还包括系列浓度标准品，所述标准品的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.1。

本发明提供上述的特异性引物和探针、实时荧光定量PCR试剂盒在如下任一中的应用：

(1)定性检测或辅助检测玉米细菌性枯萎病菌；

(2)制备定性检测或辅助检测玉米细菌性枯萎病菌的产品。