[发明专利]一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用，其包括如下步骤：确定敲除靶点；gDNA片段的扩增与体外转录；鱼胚胎注射sgRNA和Cas9蛋白；敲除纯合品系筛选；DHA含量测定。其基于CRISPR/Cas9基因敲除技术对鱼类肝脏中DHA转出的关键基因vtg1实施敲除，从而建立鱼类肝脏特异性累积DHA的动物模型，为后续针对DHA对鱼类的生理和发育影响研究，提供更精准、靶标更强的研究工具。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用。

背景技术

鱼类中富含Ω-3高度不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)，其具有很高的营养价值和生理功能，可以促进神经系统发育，保护视力，并降低心血管疾病的风险。同时，DHA在鱼类生理发育过程中亦发挥着非常重要的功能。研究表明，DHA是幼鱼神经细胞膜和视觉细胞膜的重要组成成分，具有抑制炎症和抵抗氧化应激的功能。并且，水产饲料中DHA的添加可以提高幼鱼的生长和存活率，降低畸形率，同时修复肠道损伤。上述研究表明，无论是评估水产品的营养价值，还是探究鱼类自身的生长发育调控，鱼类DHA在其中均发挥了十分重要的作用。

在鱼类生理研究中，往往需要探讨DHA在特定组织中的功能，因而需要DHA特异性地积累在某个组织中。肝脏是DHA合成和代谢调控的重要器官，因此肝脏组织特异性的DHA累积对于研究DHA所调控的分子信号通路具有十分重要的意义。

然而，迄今为止，尚无方案可以实现DHA在鱼类肝脏中的特异性累积，相关动物模型的缺乏已成为限制对DHA生理发育功能研究的障碍之一。

发明内容

针对上述技术问题，本发明提供了肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用，其基于CRISPR/Cas9基因敲除技术对鱼类肝脏中DHA转出的关键基因vtg1实施敲除，从而建立鱼类肝脏特异性累积DHA的动物模型，为后续针对DHA对鱼类的生理和发育影响研究，提供更精准、靶标更强的研究工具。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一方面，提供了一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法，其包括如下步骤：

1)确定敲除靶点：

查询鱼类vtg1(即卵黄蛋白原1)的基因序列，利用CRISPR设计工具确定鱼类vtg1基因的CRISPR/Cas9敲除靶点；

2)gDNA片段的扩增与体外转录：

以鱼类sgRNA质粒为模板，利用PCR技术扩增获得包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段，并对扩增产物进行回收、纯化；

以所述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段为模板进行体外转录，以获取包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA；

3)鱼胚胎注射sgRNA和Cas9蛋白：

将上述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA溶液和Cas9蛋白溶液注射到鱼类胚胎中；

4)敲除纯合品系筛选：

注射完成后，取部分鱼类胚胎提取鱼类基因组，并以此为模板，利用PCR技术进行扩增，并对扩增产物进行基因测序，若测序结果表明发生vtg1基因突变，则保留剩余鱼类胚胎，并养至性成熟，由此获得vtg1基因发生突变的F0代鱼类；

将F0代鱼类与野生型鱼类进行杂交，获得F1代鱼类；取部分F1代鱼类胚胎提取鱼类基因组，并进行基因测序，若测序结果表明发生vtg1基因突变，则保留剩余F1代鱼类胚胎，并养至性成熟；

提取成年F1代鱼类基因组并测序，根据测序结果筛选发生vtg1基因突变的F1代雌雄鱼类，彼此杂交，以获得F2代鱼类胚胎，并养至性成熟；