[发明专利]一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法及其应用

权利要求书

1.一种肝脏特异性积累DHA的鱼类模型构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)确定敲除靶点：

查询鱼类vtg1的基因序列，利用CRISPR设计工具确定鱼类vtg1基因的CRISPR/Cas9敲除靶点；所述鱼类vtg1基因的CRISPR/Cas9敲除靶点序列为ATAGTGTGTTCTGCAC；

2)gDNA片段的扩增与体外转录：

以鱼类sgRNA质粒为模板，利用PCR技术扩增获得包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段，并对扩增产物进行回收、纯化；且利用PCR技术扩增获得包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段时，上游引物序列为：ATAGTGTGTTCTGCAC，下游引物序列为：AGCACCGACTCGGTGCCACT；

以所述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的gDNA片段为模板进行体外转录，以获取包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA；

3)鱼胚胎注射sgRNA和Cas9蛋白：

将上述包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA溶液和Cas9蛋白溶液注射到鱼类胚胎中；

4)敲除纯合品系筛选：

注射完成后，取部分鱼类胚胎提取鱼类基因组，并利用PCR技术进行扩增，并对扩增产物进行基因测序，若测序结果表明发生vtg1基因突变，则保留剩余鱼类胚胎，并养至性成熟，由此获得vtg1基因发生突变的F0代鱼类；

将F0代鱼类与野生型鱼类进行杂交，获得F1代鱼类；取部分F1代鱼类胚胎提取鱼类基因组，并进行基因测序， 若测序结果表明发生vtg1基因突变，则保留剩余F1代鱼类胚胎，并养至性成熟；

提取成年F1代鱼类基因组并测序，根据测序结果筛选发生vtg1基因突变的F1代雌雄鱼类，彼此杂交，以获得F2代鱼类胚胎，并养至性成熟；

提取成年F2代鱼类基因组并测序，根据测序结果筛选出vtg1基因已被敲除的纯合F2代鱼类；

5)DHA含量测定：

测定所述纯合品系中雌性鱼类肝脏的DHA含量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，包含有鱼类vtg1基因敲除靶点的sgRNA终浓度为300-600ng/μl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，注射时，sgRNA溶液与Cas9蛋白溶液的体积比为1：(0.8-1.5)。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，注射时，在鱼类的单细胞胚胎期进行注射，且将上述sgRNA溶液与Cas9蛋白溶液注射到胚胎的动物极。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，采用鱼类胚胎注射仪进行注射，且参数设置为：Pout值为15，Pinject值为40-50。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，将鱼类胚胎养至性成熟的过程包括：在胚胎孵化后5-7天，使用研磨的蛋黄溶液投喂幼鱼；在胚胎孵化后7-10天，使用蛋黄溶液和草履虫混合投喂；在胚胎孵化后10天至性成熟阶段，使用丰年虫和商业饲料混合投喂。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，利用PCR技术对鱼类基因组进行扩增时，其上游引物序列为：ATGGATCCTCTACTCTACGAG，下游引物序列为：AGTGACTGCTATCCAGTCCTT。

8.一种通过权利要求1-7任一项所述方法制备得到的鱼类模型在研究DHA在鱼类肝脏特异性累积中的应用。