[发明专利]快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒

说明书

快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒，涉及一种猫杯状病毒的检测方法及检测用引物和试剂盒。本发明保护上游引物ERA‑F、下游引物ERA‑R、探针Probe。试剂盒包含上述的引物及探针、阳性对照样品、等温核酸扩增试剂盒和试纸条。检测方法：一、配置检测溶液；二、用试纸条检测步骤一反应产物，获得检测结果。本发明采用引物和探针组合的方式，通过RT‑ERA技术对猫杯状病毒进行快速检测。本发明的引物和探针组合是针对猫杯状病毒ORF1保守区域设计，具有灵敏性高、特异性强和重复性好等优点，与猫疱疹病毒、猫细小病毒以及猫传染性腹膜炎病毒均无交叉反应。

技术领域

本发明涉及一种猫杯状病毒的检测方法及检测用引物和试剂盒。

背景技术

猫杯状病毒(Feline Calicivirus，FCV)是引起猫呼吸系统疾病的高度流行病原体，常感染一岁以下的幼猫，猫感染FCV后通常会引起的临床表现为口腔溃疡、发热、打喷嚏、鼻炎、结膜炎，非典型症状可引起跛行、腹泻或致死性全身性疾病(Virulent SystemicDisease，VSD)。临床病猫康复后以及无症状携带者仍可长期排毒，有利于FCV在猫群中的扩散，是重要的传染源。

目前，FCV的检测方法有血清学检测法和病毒学检测法，血清学检测包括血清中和试验、琼脂扩散试验、免疫荧光或酶联免疫法等，这些方法相对耗时。病毒检测法，包括电镜检查、RT-PCR、荧光定量RT-PCR及抗原捕获胶体金检测方法等，；但是由于猫杯状病毒属于RNA病毒，具有高度变异性，制备的单克隆抗体无法具有通用性，抗原捕获胶体金检测方法多存在假阴性；RT-PCR、荧光定量RT-PCR等方法，都需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员进行操作，不能满足非实验室等基层现场条件下的检测要求。

发明内容

本发明为了解决上述技术问题，提供了一种快速检测猫杯状病毒的方法及检测用引物和试剂盒。

快速检测猫杯状病毒的引物及探针的上游引物ERA-F的序列为：5'-GTCTCAAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAAC-3'；

快速检测猫杯状病毒的下游引物ERA-R的序列为：5’-Biotin-ACTTAGGACATACATCATAACTAGCACAAG-3’；

快速检测猫杯状病毒的探针Probe的序列为：5’-FAM-AAACTCTGAGCTTCGTGCTTAAAACTCACA[THF]TGTCCGTAAGGACTT-C3Spacer-3’。

快速检测猫杯状病毒的RT-ERA核酸试纸条扩增试剂盒包含上述的引物及探针、阳性对照样品、等温核酸扩增试剂盒和试纸条；

其中，阳性对照样品中含猫杯状病毒ORF1区域RNA序列；

等温核酸扩增试剂盒中包括重组酶冻干酶粉、溶解剂、激活剂、RNA酶抑制剂和RNase-free H₂O。

快速检测猫杯状病毒的方法：

一、在离心管中配置下列溶液：15μL溶解剂、2.1μL上游引物ERA-F、2.1μL下游引物ERA-R、0.6μL探针Probe、0.5μL RNA酶抑制剂和2～6μL待测样品，RNase-free H₂O补充至48μL，振荡混匀并离心；将上述48μL的混合溶液转移至含有重组酶冻干酶粉的反应管中，振荡混匀直至完全溶解，再在反应盖上加2μL激活剂，离心5～6s后，40℃水浴锅中反应30min；

二、用试纸条检测步骤一反应产物，获得检测结果；

①阴性：仅在质控线有一条红色条带，在检测线没有红色条带，表明待检样本无猫杯状病毒感染；

②阳性：在质控线和检测线均有一条红色条带，表明待检样本中有猫杯状病毒感染；

③无效：在质控线和检测线均无红色条带，表明试纸条失效。