[发明专利]一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备R-3-氨基丁酸的方法

说明书

本发明公开了一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备R‑3‑氨基丁酸的方法，通过基因工程，在原基因的两端分别增加一段带有多个氨基且为极性氨基酸残基的多肽链，基于该序列通过生物发酵获得酶液，与树脂固定获得固定化酶。该固定化酶减少了固定化载体与蛋白质共价结合对酶活性中心结合几率，从而降低固定化后对酶活损害，使酶活回收率最高能提高到50%以上，且由于增加极性氨基酸数量，提高可用于转化底物浓度，在工业化酶发酵工程中大大降低酶的成本并节约生产工序。

技术领域

本发明涉及酶工程和生物催化领域，具体地说涉及一种重组天冬氨酸裂解酶及高重复利用率用于制备R-3-氨基丁酸的方法。

背景技术

中国专利ZL 201810198044.8（公开日：2018年08月07日）公开了一种R-3-氨基丁酸的制备方法，该方法以较高浓度的巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，在碱性条件下加入重组天冬氨酸酶进行生物催化，获得98%以上的转化率。其中的重组天冬氨酸酶是基于芽孢杆菌重组天冬氨酸酶的基因获得的。

该酶可用于树脂作为载体进行固定化，该方法主要是酶以共价键结合于载体上即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。其优点在于：酶与载体结合牢固，稳定性好；但缺点在于：采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白的高级结构的变化，有机率破坏活性中心，所以往往不能得到比活高的固定化酶。

大部分酶与树脂固定后，酶的活性会受到很大影响。前述重组天冬氨酸酶利用树脂进行固定化后，酶活回收率只有10%，几乎无法制备固定化酶，可见载体与酶蛋白结合后会使其失活变性。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种用于树脂载体固定并具有高重复利用率的重组天冬氨酸裂解酶及其编码基因；本发明还提供了前述基因片段的重组表达载体和对应的宿主细胞；本发明还有一个目的是提供基于前述重组天冬氨酸裂解酶固定化酶的高重复利用率制备R-3-氨基丁酸上的方法。

技术方案：一种重组天冬氨酸裂解酶，具有由第一序列SEQ ID NO.1和第二序列依次串联形成的氨基酸序列，其中，所述第一序列和第二序列的长度分别为SEQ ID NO.1的2-5%，任意氨基酸选自C半胱氨酸、G甘氨酸、H组氨酸、K赖氨酸、N天冬氨酸、Q谷氨酰胺、R精氨酸、S丝氨酸、T苏氨酸、Y酪氨酸中的任意一个。

本发明所述SEQ ID NO.1序列与ZL 201810198044.8公开的序列相同，其能在高浓度底物下进行酶催化反应，获得手性纯度不低于99.95%，杂质纯度不低于99%，含量不低于99%，产品收率不低于85%的R-3-氨基丁酸。酶催化的反应原理和酶制备方法参见ZL201810198044.8的说明书记载。本发明在现有技术的基础上，进一步探讨了如何提高该酶的重复利用率，通过在3’端和5’端分别增加两条亲水序列，显著提高了重复利用率，并维持较高的酶催化转化率。

值得注意的是，所述两条亲水序列的长度分别为SEQ ID NO.1的2-5%，且两条序列的氨基酸选自半胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸中的任意一个，而其他亲水氨基酸构建的酶稳定性不足，或显著降低转化率。优选地，两条亲水序列中精氨酸、赖氨酸应保证较高的含量，不少于任一亲水序列的20%。具体地说，所述第一序列中的精氨酸比例不少于10%，赖氨酸比例不少于10%，组氨酸比例不少于9%。所述第二序列中的精氨酸比例不少于20%，赖氨酸比例不少于15%。

具体地说，所述第一序列为SEQ ID NO.2，氨基酸序列为TCRKSYHKQGNRYQTYSRCKH；第二序列为SEQ ID NO.3，氨基酸序列为CHTSYGRYRKQRK。