[发明专利]一种冷冻保护剂及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种含两亲性化合物的冷冻保护剂及其制备方法和应用，本发明的两亲性化合物由葡萄糖酸内酯和缬氨酸反应制备而成，基于两亲性化合物良好的水溶性及两亲性(亲冰性和亲水性)，因而可以在冷冻细胞、组织或器官复苏过程中有效地抑制冰的结晶和/或重结晶，以避免细胞、组织或器官因冰晶生长过快而导致的损伤。本发明的两亲性化合物用于细胞(特别是人骨髓来源的间充质干细胞)、组织或器官的冷冻保存具有优异的细胞恢复率，而无需加入DMSO，且本发明的冷冻保护剂成分简单，可保持良好的生物相容性，具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种冷冻保护剂及其制备方法和应用。

背景技术

冷冻保存技术是一种利用极低温使活细胞、器官和组织保存结构完整性的有效途径，该方法能够使长期储存于低温环境下(通常是在液氮或液氮蒸汽中)的细胞、组织和器官，从其新陈代谢极低甚至停止的状态后恢复正常功能。迄今为止，冷冻保存技术在辅助生殖医学、干细胞技术、细胞治疗、组织工程、抗癌药物开发和体外筛选、药理学、基础科学研究等生物医学领域取得了突破性进展。其中，间充质干细胞(MSCs)是细胞治疗领域的宝贵资产。人骨髓来源的间充质干细胞(hBM-MSCs)是临床试验中最常用的细胞类型之一。从而引发了大量学者对其进行研究和测试，以期为各种各样的疾病和病症的治疗提供有效途径。然而在冷冻保存过程中，冰的结晶及其重结晶会造成细胞、组织和器官在损伤及死亡的主要原因之一。玻璃化冷冻保存方法(抑制冰晶成核)是一种利用超快速冷冻与高浓度的冷冻保护剂相结合，以实现溶液快速穿越水的结晶区达到溶液玻璃态的冷冻保存方法，该方法被认为是一种很有前途的冷冻方法，已被广泛地应用于细胞、组织和器官的冷冻保存领域。然而在复温解冻的阶段，退玻化导致的冰晶的成核及重结晶依旧会发生。这种不受控制的冰重结晶/生长将会对细胞带来致命损伤，会导致细胞功能的减弱甚至丧失，如会导致干细胞失去自发分化能力，使冷冻保存的干细胞丧失在细胞药物中的应用。为了避免冰的结晶及其重结晶给细胞带来风险，常常采用高浓度的有机溶剂(如二甲基亚砜(DMSO)等(10-15％)，以在冷冻保存过程中实现低温保存介质的玻璃化和无冰凝固。然而，DMSO具有细胞毒性和表观遗传毒性，美国FDA规定，非特殊、非不可替代情况禁止其使用。综上，目前采用的冷冻保护剂不具备冷冻过程中有效控制冰晶生长的能力，同时存在试剂毒性大的问题。

为了突破细胞冷冻保存的瓶颈，并消除DMSO毒性造成的临床风险，因此，开发新型高效、安全、具有生物兼容性的可抑制/控制冰晶生长以及再结晶的抑冰/控冰材料，以期能够改善现有技术冷冻保存存在的上述技术问题，并得到能够用于间充质干细胞、尤其是人骨髓来源的间充质干细胞的冷冻保护剂，成为本领域亟待解决的技术问题。

发明内容

为了改善上述技术问题，本发明提供一种冷冻保护剂，其包含式(I)所示结构的两亲性化合物：

根据本发明的实施方案，所述两亲性化合物可以采用葡萄糖酸内酯与缬氨酸反应制备得到。

根据本发明的实施方案，所述冷冻保护剂还包含缓冲液。其中，所述缓冲液可以选自本领域已知的细胞培养缓冲液，例如PBS缓冲液、DPBS缓冲液、MEM缓冲液、DMEM缓冲液、hepes-buffered HTF缓冲液或其他细胞培养缓冲液中的任一种，优选PBS缓冲液。在本发明的一个实施方案中，所述PBS缓冲液的pH为7.0-7.4。

根据本发明的实施方案，所述冷冻保护剂还可以包含水溶性糖和/或多元醇。

优选地，所述水溶性糖可以选自蔗糖、海藻糖、半乳糖、聚蔗糖和葡聚糖等中的至少一种，优选为蔗糖和/或海藻糖。

优选地，所述多元醇可以选自乙二醇、β-巯基乙醇、甘油、1,3-丙二醇、1,2-丙二醇和2,3-丁二醇等中的至少一种，优选为乙二醇。