[发明专利]胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用

说明书

本发明提供了一种胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用。本发明发现猪胰蛋白酶的一些位点与其活性及稳定性密切相关，基于此获得了一类胰蛋白酶突变体，与野生型相比，所述突变体的酶活性及稳定性更好。本发明也提供了所述胰蛋白酶突变体的应用。本发明也提供了优化的表达胰蛋白酶突变体的方法，其产量高、生产成本低、适合规模化生产。

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，本发明涉及一种胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用。

背景技术

胰蛋白酶是一种广泛存在于自然界中的丝氨酸蛋白酶，在细菌、真菌和哺乳动物中均有发现。在哺乳动物中，胰蛋白酶与新陈代谢、消化和凝血密切相关。胰蛋白酶被广泛应用于皮革、生物技术、医药和食品加工产业。例如在生物制药工业中将单链胰岛素前体转化为双链胰岛素，在动物细胞培养中消化细胞，以及质谱检测中消化蛋白质等。

胰蛋白酶在胰腺中以前酶原(Pretrypsinogen)形式生成，通过N端15个氨基酸组成的疏水信号肽从胰腺中分泌出来，分泌过程中信号肽被切除生成无活性的胰蛋白酶酶原(Trypsinogen)。该胰蛋白酶酶原N端由23个氨基酸组成激活肽，该激活肽被肠激酶(Enterokinase)或胰蛋白酶切除后生成具有活性的胰蛋白酶(Trypsin)。胰蛋白酶可裂解碱性氨基酸(赖氨酸或精氨酸氨)羧基端的肽键，如果脯氨酸在裂解位点的羧基一侧，则不会发生裂解，如果酸性氨基酸(谷氨酸或天冬氨酸)在裂解位点的两侧，则水解速度较慢。有活性的胰蛋白酶由223个氨基酸组成，含有6对保守的二硫键，三维结构整体呈球状，由N端和C端各6股反向平行的β片层组成的桶装结构域组成。胰蛋白酶必须结合Ca²⁺才具有酶活性，其钙离子结合坏(calcium-binding loop)与Ca²⁺相互作用，Ca²⁺参与胰蛋白酶三维结构的稳定，促进其水解底物的酶活性，并保护其免于发生自降解(autolysis)。其带负电的S1结合位点疏水口袋，决定了胰蛋白酶对底物P1位点为赖氨酸或精氨酸的特异性。激活后的胰蛋白酶因其三维结构表面存在暴露的赖氨酸或精氨酸易发生自降解，从单链形式的β-胰蛋白酶转化为内部由二硫键相连的双链α-胰蛋白酶，进一步的自降解会产生γ、δ、ψ形式的胰蛋白酶乃至碎片。自然条件下的胰蛋白酶主要形式是α-胰蛋白酶，其次是β-胰蛋白酶，α和β-胰蛋白酶的活性、热稳定性不同。

虽然动物胰腺提取的胰蛋白酶产品已被广泛应用，但是存在生产工艺复杂、胰蛋白酶得率较低、胰蛋白酶活性低或稳定性差、胰蛋白酶原激活方式不可控导致的蛋白纯度不均一、潜在动物污染等问题。随着市场对胰蛋白酶质量需求的提高，已有利用基因工程技术表达的重组胰蛋白酶产品问世，主要采用丝状真菌、酵母或大肠杆菌表达系统。利用丝状真菌表达系统将重组胰蛋白酶分泌到培养基中(见专利WO97/00316)，但是宿主细胞自身产生的蛋白酶易导致重组胰蛋白酶原的激活，从而影响重组胰蛋白酶的产量和纯度。利用酵母表达系统将重组胰蛋白酶分泌到培养基中(见专利WO 01/55429)，但其存在筛选稳转株周期长、筛选抗生素昂贵、诱导试剂(甲醇)残留和不规则糖基化导致重组蛋白构象不均一等缺陷。利用大肠杆菌表达系统在周质空间表达可溶重组胰蛋白酶的产量很低，而通过表达包涵体蛋白进行复性制备的重组胰蛋白酶(见专利CN106754842A)的复性率只有约10％，且在后续工业大规模纯化中损失严重，纯化方法无法区分错误折叠不具有胰蛋白酶活性和正确折叠具有胰蛋白酶活性的蛋白，导致终产品的酶比活较低。

综上所述，现有重组胰蛋白酶还亟待进一步加以优化以提高其性能，同时其表达、纯化技术存在包涵体蛋白复性率低、生产耗时长和生产成本高等问题也亟待解决。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用。