[发明专利]胰蛋白酶突变体、其制备方法及其应用有效
| 申请号： | 202110333251.1 | 申请日： | 2021-03-29 |
| 公开（公告）号： | CN113061598B | 公开（公告）日： | 2022-07-15 |
| 发明（设计）人： | 葛新建;马丽娜 | 申请（专利权）人： | 上海碧云天生物技术有限公司 |
| 主分类号： | C12N9/76 | 分类号： | C12N9/76;C07K19/00;C12N15/70;C12N1/21;C12P21/06;C12R1/19 |
| 代理公司： | 上海专利商标事务所有限公司 31100 | 代理人： | 陈静 |
| 地址： | 201611 上海*** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 胰蛋白酶 突变体 制备 方法 及其 应用 | ||
1.一种胰蛋白酶突变体，其是：
(a) 氨基酸序列选自SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 9或SEQ ID NO: 11的胰蛋白酶突变体；或
(b) 在(a)酶的氨基酸序列的多肽的N或C末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其N末端添加信号肽序列后形成的多肽。
2.一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的胰蛋白酶突变体。
3. 如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO: 12或其第7-678位序列。
4. 如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO: 10或其第7-678位序列。
5.一种载体，其含有权利要求2-4任一所述的多核苷酸。
6.如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述载体还包括编码SUMO标签和/或His标签的核苷酸序列。
7. 如权利要求6所述的载体，其特征在于，包括编码His-SUMO3标签的核苷酸序列，所述His-SUMO3标签的氨基酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
8.如权利要求7所述的载体，其特征在于，该载体表达的融合蛋白中，His-SUMO3标签蛋白的C端连接权利要求1所述的胰蛋白酶突变体。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其含有权利要求5-8任一所述的载体，或基因组中整合有权利要求2-4任一所述的多核苷酸；所述的宿主细胞为原核细胞。
10.如权利要求9所述的遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。
11. 一种提高胰蛋白酶的活性或稳定性的方法，包括改造SEQ ID NO: 1所示的胰蛋白酶，形成氨基酸序列选自下组的胰蛋白酶突变体：SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 9或SEQ IDNO: 11。
12.权利要求1所述的胰蛋白酶突变体的制备方法，该方法包含：
(i) 培养权利要求9-10任一所述的宿主细胞；
(ii) 收集含有所述的胰蛋白酶突变体的培养物；
(iii) 从培养物中分离出所述的胰蛋白酶突变体。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，当胰蛋白酶突变体的核苷酸序列与编码SUMO标签和/或His标签的核苷酸序列融合表达、获得融合蛋白包涵体后，还包括：包涵体变性、复性、纯化的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述的纯化步骤中，包括：添加SUMO蛋白水解酶、切割融合蛋白、分离获得所述胰蛋白酶突变体。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述SUMO蛋白水解酶为SUMO特异性蛋白酶2。
16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，以His-SUMO3标签与所述胰蛋白酶突变体融合表达，对获得的包涵体蛋白进行清洗、溶解，之后进行复性。
17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，清洗液包括：10-50mM三羟甲基氨基甲烷pH7.4，0.1-1M NaCl，0.1-1% Triton X-100。
18. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，溶解液包括：6-8M尿素，5-50mM 二硫苏糖醇，10-50mM三羟甲基氨基甲烷pH8.0。
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