[发明专利]一种用于敲低人CBS基因的载体、制剂及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种用于敲低人CBS基因的载体、制剂及其制备方法和应用，涉及生物制药技术领域，所述载体的制备方法包括：依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列见SEQ ID NO.1；对GV102载体中的限制性酶切位点BamH I和HindⅢ进行酶切，形成线性化GV102载体，所述GV102载体顺序为：hU6‑MCS‑CMV‑GFP‑SV40‑Neomycin；将上两步的产物进行连接构建GV102‑CBS载体。本发明制备的载体能够显著抑制人CBS基因的表达，达到抑制人甲状腺癌细胞增长、降低癌细胞迁移率的目的，可用于制备治疗人甲状腺癌的制剂之中。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种用于敲低人CBS基因的载体、制剂及其制备方法和应用。

背景技术

甲状腺癌（thyroid carcinoma）是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，属于甲状腺上皮的肿瘤，它包括四种病理类型，分别是乳头状癌、滤泡状癌、未分化癌和髓样癌。除髓样癌外，大约90%的甲状腺癌起源于滤泡上皮细胞。乳头状癌为最常见的恶性程度较低、预后较好的一种甲状腺癌。目前国内外对于甲状腺癌治疗的手段主要包括外科手术、促甲状腺素抑制治疗、生物治疗和中药治疗。但是还没有通过制备敲低胱硫醚β合成酶(CBS)基因的相关药物来治疗甲状腺癌的报道。

胱硫醚β合成酶(CBS)是一种细胞质中的同源四聚体，由63KD的亚基组成，是一种磷酸吡哆醛(pyridoxalphosphate,PLP)依赖性酶。人类CBS基因编码一种551个氨基酸的蛋白质，由四个63-kDa亚基组成的人CBS活性形式。每个亚单位由三个结构域组成，N端结构域与辅因子血红素结合，这是蛋白质成功折叠和组装所必需的。催化结构域包含另一种辅因子PLP 的结合位点。碳末端调节结构域包含两个CBS基序(CBS1和CBS2)，它们二聚形成贝特曼结构域。这个域名负责亚单位四聚化并含有变构激活剂S-腺苷甲硫氨酸的结合位点。在天然的四元结构中，底物进入催化核心的途径被碳末端调节基序封闭，SAM的结合诱导构象变化，从而改善底物进入催化位点的途径。CBS参与了有助于内源性硫化氢(H₂S)产生的脱硫反应。CBS主要通过控制半胱氨酸（Hcy）和H₂S代谢发挥多种生物学功能，包括线粒体生物能学、氧化还原稳态、DNA 甲基化和蛋白质修饰。CBS 的去调控和相关的Hcy 和/或H₂S水平的改变导致心血管、免疫和中枢神经系统的广泛病理紊乱，并导致疾病的发展。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种用于敲低人CBS基因的shRNA，所述shRNA的具体序列见SEQ ID NO.1。

本发明还提供一种用于敲低人CBS基因的载体，所述载体包含本发明所述shRNA。

本发明还提供一种用于敲低人CBS基因的载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1：依据人CBS基因序列，设计引物，用于PCR扩增目的基因，具体序列见SEQ IDNO.1；

具体序列如下：CAAGGTCGGGCAGGAAGAG,TAATACGACTCACTATAGGG

S2：对GV102载体中的限制性酶切位点BamH I和Hind Ⅲ进行酶切，形成线性化GV102载体，所述GV102载体顺序为：hU6-MCS-CMV-GFP-SV40-Neomycin；

S3：将步骤S1和步骤S2的产物进行连接构建GV102-CBS载体。

本发明还提供一种用于敲低人CBS基因的制剂，所述制剂含有本发明所述载体。

本发明还提供一种本发明所述载体在制备治疗人甲状腺癌的制剂中的应用。

本发明的有益效果：

本发明制备的载体能够显著抑制人CBS基因的表达，达到抑制人甲状腺癌细胞增长、降低癌细胞迁移率的目的，可用于制备治疗人甲状腺癌的制剂之中。