[发明专利]一种快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法

说明书

一种快速判定草莓植株是否感染主要病毒的方法，目的是具有准确高效特点，可进行高通量精准检测；本发明用基于双端标记的锁核酸八聚体荧光探针(Dual‑Labeled LockedNucleic Acid Probe)的实时荧光定量核酸酶链式反应(qPCR)，以脱氧核糖核酸(DNA)和互补脱氧核糖核酸(cDNA)的混合物为模板，用多对病毒特异引物通过一次qPCR反应判定所检测的草莓材料中是否被主要病毒感染。

技术领域

本发明涉及农业种苗繁育和种植生产领域，具体涉及草莓种苗繁育和种植生产过程中的病毒检测。

背景技术

据不完全统计，我国草莓栽培面积已达250万亩，居世界首位。每年生产上需要优质草莓生产用商品苗200亿株以上，经济价值可达160亿元。我国每年需原种一代苗10亿株以上，经济价值可达30亿元，每年需原种苗5000万株以上。草莓种苗的繁育一般采用营养繁殖方法，通过母株生发匍匐茎产生子株而扩大数量，在生产过程中由于无可避免的虫害，植株会感染和积累病毒，从而影响种苗的质量，种苗的质量是影响生产和效益的主要因素，无病毒种苗的制备则成为整个草莓产业的关键因素。目前一般采用热处理后微茎尖组织培养的方法脱除病毒制成原原种苗，然后扩繁形成原种苗，之后进一步扩繁形成生产种。这种方法也称为三级育苗体系。在此过程中需要病毒检测，一方面需要保证病毒脱除效果，另一方面也需要监测在次一级的种苗扩繁过程中病毒复染情况。检测方法主要有以下几种：1、接种指示植物：该方法比较传统，需要有指示植物，检测周期长，时间成本高；2、酶联免疫法：该方法需要有相应的抗体蛋白，往往存在难以购买或制备的问题；3、PCR法：是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称,可以将几个或几十个拷贝数DNA片段扩增至上百万份拷贝的方法。该方法通过扩增病毒的特有核酸片段判定病毒的有无，具有快速的特点，是目前比较常用的方法。4、qPCR法：quantitative PCR,也称实时定量PCR，用基于荧光染料或荧光探针的qPCR检测，其原理是荧光染料嵌入DNA的双链中产生荧光，或探针水解后释放荧光。荧光信号随PCR扩增产物的增加而增加，通过实时监测荧光信号的强弱来判断目标片段的有无和多少。前者非特异的扩增会产生假阳性，后者因为荧光探针的特异性增强了准确性。目前世界上发现感染草莓的病毒有二十多种，在我国主要有四种较为普遍并产生危害，包括草莓镶脉病毒、草莓斑驳病毒、草莓皱缩病毒和草莓轻型黄边病毒。其中皱缩病毒能单独引起叶片皱缩，从而在形态学上比较容易直观识别，其它三种病毒为潜隐性病毒，即单独感染没有明显症状，从形态学上较难识别，但仍然显著影响植株的长势和产量。由于种植条件和管理水平也能显著影响植株的长势和产量，在生产过程中无论是判定原因还是确保种苗的无病毒特性，检测这三种潜隐性病毒都十分必要。我国目前一般采用PCR的方法通过DNA扩增，然后通过电泳显示目标条带来判定病毒的有无。该法需要三次PCR反应针对不同的病毒，存在假阳性和假阴性的可能性。在草莓原种苗制备过程中或草莓种植生产过程中，一般情况下，只需要或者最主要的是判定是否被病毒感染，即可决定取舍。本专利所述的快速检测三种主要草莓病毒的方法，是荧光标记探针而非荧光染料,且探针的序列包含于三种病毒各自的扩增产物的目标序列中，不但极大提高了检测的准确度和灵敏度，也提高了检测效率。PCR扩增时在加入三对引物的同时加入这个特异性的共有荧光探针，该探针为双端标记的八聚体锁核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团6-FAM和一个淬灭荧光基团BHQ-1。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。PCR反应体系中，当标记有荧光基团的罗氏通用探针与模板DNA混合后，随着反应的进行，逐步完成高温变性、低温复性、适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应（PCR）原理，与模板DNA互补配对的罗氏通用探针被聚合酶解离，荧光基团游离释放到反应体系中，在特定波长光激发下发出特定荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，相应的荧光也随之增强。通过实时检测随PCR扩增而发生变化的荧光信号强度，与正负对照相比较，判断出模板中目标序列的有无及计算出其相对含量，或得到反应的Ct值，同时通过已知模板浓度的标准品作对照，即可计算出待测标本目的基因片段的拷贝数。