[发明专利]一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其合成方法

说明书

本发明公开一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷‑5’‑三磷酸及其合成方法，部分合成步骤：化合物3或1与三氯乙酸进行脱保护反应，分别得到^SeT即是4Se或^ST即是4S；然后，通过一锅合成法将化合物4Se和4S分别转化为化合物5Se和5S，^SeTTP即是化合物5Se和^STTP即是化合物5S；接下来，将化合物5Se和5S纯化后通过进行表征，以确认其结构和纯度，然后用^SeTTP或^STTP和DNA聚合酶进行DNA酶促合成，得到化合物6，即是Se‑DNA或S‑DNA或硒硫代Se/S‑DNA；本发明通过创新合成^SeTTP和^STTP的方法，以及创新DNA聚合酶促合成的方法，建立了硒或硫原子特异性修饰策略SAM,以抑制DNA聚合中的T/G错配，提高碱基配对的特异性，并证明了SAM方法可以提高聚合酶反应、核酸分子识别和分子检测的准确性和灵敏性。

技术领域

本发明涉及修饰三磷酸合成以及核酸分子检测技术领域，尤其涉及一种硒或硫代胸腺嘧啶核苷-5’-三磷酸及其核酸合成以及核酸分子检测运用的方法。

背景技术

核酸分子检测和核酸测序是病原体、肿瘤、疾病和环境检测鉴定和流行病控制的重要基础和依据。其中，碱基配对是核酸分子识别的基础，它们在研究包括核酸诊断、分子序列识别、测序分析、遗传信息存储、DNA复制、RNA转录和蛋白质翻译，等等机制发现和实际应用方面具有重要意义。此外，DNA碱基(T/A和C/G)的正常准确配对和堆叠决定了DNA双链的结构和稳定性。然而，RNA中的非正常碱基对(如U/G)，使RNA结构多样化，增强RNA功能，如核酶和病毒的RNA。但是，在DNA识别和合成中并不欢迎非正常碱基对(如碱基摆动配对T/G，典型的错配)，因为它们会导致突变并降低DNA聚合的特异性。T/G配对的产生是通过胸腺嘧啶碱基上2-氧形成G摆动氢键导致的，而2-氧并不参与T/A碱基对。由于在同族元素中，硒的原子半径比氧的原子半径大得多，而且硒形成的氢键能力很差，2-硒并不参与^SeT/A配对，因此，硒修饰后，2-硒胸腺嘧啶碱基不再与G碱基摆动配对，但并不影响2-硒胸腺嘧啶碱基与A碱基配对。

现有技术中，主要使用商业化的RT-PCR或PCR或RT-qPCR或qPCR核酸检测试剂盒进行病原体、肿瘤、疾病和环境核酸的检测。在RNA反转录(RT,reverse transcription)之后，DNA分子检测的基本原理如下所述：以TaqMan探针为例，TaqMan探针是一段寡核苷酸单链，与目标DNA互补，探针两端分别有一个报告基团和一个淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，不会检测到荧光，PCR扩增时，Taq DNA聚合酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，报告基团释放并发出荧光。每合成一条DNA链，就会切断一条探针，并产生一个单位荧光信号，信号的强度与结合到DNA链上的探针成正比，如图1所示。

现有技术最大的痛点问题在于针对低拷贝数下，病原体、肿瘤、疾病和环境核酸样本检测的灵敏的不够高，导致假阴性结果的产生。这是因为现有技术在检测过程中，由于有错配的存在(尤其是典型的T/dG和T/rG摆动错配)，会导致低拷贝核酸分子的信号偏弱，背景噪音会将其淹没，无法被仪器准确检测到。由于病原体有可能会快速传播(例如新冠病毒)，因此，解决假阴性的痛点问题显得尤为重要。

发明内容