[发明专利]一种氧化葡萄糖酸杆菌中提高2-KLG产量的方法

说明书

本发明公开了一种氧化葡萄糖酸杆菌中提高2‑KLG产量的方法，属于基因工程和生物工程技术领域。本发明利用基于sacB的基因组编辑系统，在氧化葡萄糖酸杆菌的末端氧化酶bo₃翻译起始位点上游插入强启动子P₁₁₄增强了末端氧化酶bo₃表达量，促进了酶催化过程中的辅因子再生及电子传递，减少了活性氧的产生，过量表达山梨糖/酮脱氢酶SNDHSDH后得到的2‑KLG产量是野生型氧化葡萄糖酸杆菌WSH‑003过量表达SNDHSDH得到的2‑KLG产量的2.44倍。

技术领域

本发明涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌中提高2-KLG产量的方法，属于基因工程及生物工程技术领域。

背景技术

氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)是一种好氧、杆状革兰氏阴性菌，因其卓越的糖醇不完全氧化能力，在维生素C、二羟基丙酮、米格列醇等诸多产品生产中发挥着重要作用。氧化葡萄糖酸杆菌非凡的底物转化能力主要依赖于其细胞膜上众多高活性的酶，这些酶通常以吡咯喹啉醌(PQQ)或者黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)为辅因子，酶催化产生的电子理论上直接传递给辅酶Q₁₀(CoQ₁₀)进行辅因子的再生，被还原的CoQ₁₀再经末端氧化酶bo₃或bd氧化。膜上的酶、CoQ₁₀与末端氧化酶构成了酶催化的辅因子再生及电子传递链系统。

高强度的底物不完全氧化产生大量的电子，这些电子有的可能来不及经电子传递链传递而导致电子泄露，这些泄露的电子产生大量活性氧，如过氧化氢等，严重影响细胞的正常生理状态。在好氧发酵条件下，末端氧化酶bo₃发挥着主要作用。因此，提高末端氧化酶bo₃表达量可能促进CoQ₁₀的再生，进而促进整个电子传递链的电子传递能力，减少活性氧的产生，降低对细胞正产生理状态的影响，改善酶催化环境。

发明内容

[技术问题]

现有技术都是通过对外源表达山梨糖脱氢酶的基因sdh、编码山梨酮脱氢酶的基因sndh的质粒进行基因工程改造来达到2-KLG产量的提升，没有直接对氧化葡萄糖酸杆菌基因组直接进行编辑来提高2-KLG产量的方法。

[技术方案]

本发明通过sacB基因组编辑系统，对氧化葡萄糖酸杆菌基因组进行改造，以提供一种可以提高2-KLG产量的重组菌。

本发明通过基于sacB的基因组编辑系统，构建出一个氧化葡萄糖酸杆菌基因组上末端氧化酶bo₃前插入了强启动子P₁₁₄的重组菌。

本发明的第一个目的是提供一株重组菌，所述重组菌是以氧化葡萄糖酸杆菌为出发菌株；所述重组菌基因组上末端氧化酶bo₃上游含有启动子P₁₁₄。

在一种实施方式中，所述氧化葡萄糖酸杆菌包括氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)WSH-003。

在一种实施方式中，所述重组菌还过表达山梨糖/酮脱氢酶SNDHSDH。

在一种实施方式中，所述过表达山梨糖/酮脱氢酶是将含有山梨糖/酮脱氢酶基因的质粒转入氧化葡萄糖酸杆菌。

在一种实施方式中，所述含有山梨糖/酮脱氢酶基因的质粒包括但不限于pBBRMCS5。

在一种实施方式中，所述山梨糖/酮脱氢酶基因受启动子P₁₁₄启动表达。

在一种实施方式中，所述启动子P₁₁₄的核苷酸序列为氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003基因组Scaffold3上的第468598～469103位。