[发明专利]测定含氧多环芳烃与芳香烃受体结合能力的方法

说明书

本发明公开了一种测定含氧多环芳烃与芳香烃受体结合能力的方法。所述方法利用荧光素酶报告基因法，通过检测含氧多环芳烃作用下稳定转染了pGl4.43质粒的人肝癌细胞表达荧光素酶的活性，间接反应含氧多环芳烃与芳香烃受体结合能力。本发明以与AhR有较高的结合力的苯并芘作为参考物质，测定含氧多环芳烃与芳香烃受体的结合能力，方法简单方便，快速灵敏，且结果准确可靠。

技术领域

本发明属于荧光素酶报告基因法领域，涉及一种测定含氧多环芳烃与芳香烃受体结合能力的方法。

背景技术

含氧多环芳烃(Oxygenated polycyclic aromatic hydrocarbons，OPAHs)是多环芳烃的衍生物，在环境中的含量通常与母体PAHs相似。OPAHs由一个或多个与芳香环结构相连的氧原子组成，该芳香环结构还可包含其他化学基团。OPAHs的主要理化性质有：(1)极性变大，更容易溶解在水中；(2)吸附性增强；(3)更难降解。目前对OPAHs的研究主要集中于大气中的时空分布、来源浓度等，关于OPAHs的毒性研究较少。

芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor，AhR)是配体依赖性转录因子，属于基础的螺旋-环-螺旋基序的异二聚体转录调节因子家族，其成员在基因表达网络扮演关键角色，负责许多重要生理和发育过程，并在广泛的物种和组织中产生多种多样的生物和毒性效应。

荧光素酶报告基因法的原理是以受体介导理论为基础，应用基因重组技术，将报告基因置于外源性激素反应元件的调控下，构建重组报告基因载体，应用基因转染技术导入真核细胞内。脂溶性芳香烃类物质，透过细胞膜与细胞内芳香烃受体可逆性结合，形成配体受体复合物，使芳香烃受体的构象发生改变，进入细胞核内。在细胞内配体复合体和核内转运蛋白结合形成复合物，特异性地与染色体上芳香烃应答区域结合。通过检测化学物作用下报告基因编码的酶活性或蛋白表达的变化，间接反映内源性基因的表达情况。

发明内容

本发明的目的在于提供一种测定含氧多环芳烃与芳香烃受体结合能力的方法。

实现本发明目的的技术解决方案如下：

测定含氧多环芳烃与芳香烃受体结合能力的方法，包括如下步骤：

步骤1，将pGl4.43质粒稳定转染进人肝癌细胞(HepG2细胞)，并用潮霉素B(HygromycinB)对重组细胞进行筛选获得转染成功的重组细胞；

步骤2，在培养基中加入浓度梯度的苯并芘(BaP)，刺激步骤1得到的重组细胞，检测细胞表达的荧光素酶的活性，测定重组细胞的稳定性；

步骤3，在培养基中加入浓度梯度的含氧多环芳烃，刺激步骤2中稳定表达荧光素酶的重组细胞，检测细胞表达的荧光素酶的活性，根据含氧多环芳烃浓度与荧光素酶活性的关系图，得到含氧多环芳烃的EC₅₀值。

本发明中，含氧多环芳烃的EC₅₀值越低，其与芳香烃受体结合能力越强。

优选地，步骤1中，筛选过程中，潮霉素B的浓度为200μg/mL。

优先地，步骤2中，BaP的浓度梯度为0.0020mg/L，0.0200mg/L，0.1000mg/L，0.4000mg/L，2.0000mg/L，20.0000mg/L。

优选地，步骤3中，所述的含氧多环芳烃选自蒽醌(ATQ)，9-芴酮(9-FL)，1,8-萘二甲酸酐(1,8-NAA)，1-茚酮(1-INDA)，1-萘甲醛(1-NLD)，7H-苯并[de]蒽-7-酮(BEZO)，苊醌(1,2-ACQ)，2-甲基蒽醌(2-MAQ)或1,2-苯并奎宁酮(BAQ)。