[发明专利]一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法

说明书

一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，选取可食用时期到接近成熟时期的绿色莲蓬，剥出莲子，选择果皮全部或部分呈现绿色的莲子，将莲子消毒、冲洗；在无菌环境中剥开莲子，分离出莲子的未成熟胚，除去两片子叶，使胚尖露出并进行创伤；将获得的胚尖外植体放入盛有待侵染菌液中，超声处理2～4min，后摇床侵染15‑120min，放入CAB培养基中共培养3～4天，观察侵染效果，拍照。本发明在受体植物原位进行，大大提高了瞬间转化表达率，延长了基于荷花外植体的外源基因瞬间转化可操作时间，操作方法简便、瞬时表达率高，用于荷花基因功能的快速验证，能有效地开展荷花分子育种以及功能基因的开发应用。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法。

背景技术

荷花又称莲，是莲科(Nelumbonaceae)莲属(Nelumbo)多年生水生草本植物，是世界上著名的观赏、食用和药用植物，是印度和越南国花，也是中国的十大名花之一。

目前全世界的荷花品种约在2000多个，根据荷花的用途可以分为花莲、藕莲和子莲三大系列。花莲主要以观花欣赏为主，其中亚洲莲的花型较为丰富，有单瓣、半重瓣、重瓣、重台、千瓣等花型，花色有白色、粉红色、红色和复色系列，而美洲莲仅有单瓣黄色系列。藕莲主要用地下茎——藕作为蔬菜食用，借助南方地区特有的湖泊淡水自然资源，莲藕形成了独具特色的地方优质特色产区。而子莲主要是用于生产莲子，莲子营养丰富，味美，具有食疗功效；莲叶还可以制茶，具有调节血脂等保健作用。莲子、莲子胚芽、莲藕、藕节、荷叶及荷花等都可入药。荷花作为园林植物，不仅能美化环境，还可以净化水体。因此荷花具有十分重要的经济和文化价值。

目前，荷花育种研究主要采用传统的杂交育种的方式进行，但杂交性状受到父母本表型的限制。基因工程手段的应用能够加快植物分子育种的进程，荷花的基因组测序也已经完成，但荷花的分子育种研究依然远远落后于模式植物，主要原因是荷花遗传转化体系还不成熟。

由于荷花的遗传转化研究尚未成熟，中国发明专利CN106222195A中公开了一种将外源基因转入荷花花瓣进行瞬间表达的方法，该方法存在瞬间转化效率过低、花瓣采集受季节限制等因素影响。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，在受体植物原位进行，操作方法简便、瞬时表达率高，简单方便，所需时间短，用于荷花基因功能的快速验证，能有效地开展荷花分子育种以及功能基因的开发应用。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，包括以下步骤：

1)准备阳性农杆菌

将携带有外源基因的质粒转入植物农杆菌中，挑取单克隆，经PCR电泳检测获得阳性农杆菌，备用；

2)制备菌液

挑取单克隆阳性农杆菌，转入含卡那霉素的YEB液体培养基中，过夜摇动培养16～20小时，将摇好的菌液进行常温离心，去上清，收集菌体，用侵染缓冲液重悬，菌液浓度OD600在0.4～0.8，获得侵染菌液，备用；

3)准备外植体

选取可食用时期到接近成熟时期的绿色莲蓬，剥出莲子，选择果皮全部或部分呈现绿色的莲子，将莲子用质量分数为10-20％的次氯酸钠溶液消毒10-30min，无菌水冲洗；

在无菌环境中除去水分，剥开莲子，分离出莲子的未成熟胚，除去两片子叶，使胚尖露出并创伤胚尖，得到胚尖外植体；

4)侵染、共培养

将获得的胚尖外植体放入待侵染菌液中，超声处理2～4min，后摇床侵染15-120min，放入CAB培养基中共培养3～4天，观察侵染效果。