[发明专利]一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法

权利要求书

1.一种利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，包括以下步骤：

1)准备阳性农杆菌

将携带有外源基因的质粒转入植物农杆菌中，挑取单克隆，经PCR电泳检测获得阳性农杆菌，备用；

2)制备菌液

挑取单克隆阳性农杆菌，转入含卡那霉素的YEB液体培养基中，摇动培养16～20小时，将摇好的菌液进行常温离心，去上清，收集菌体，用侵染缓冲液重悬，菌液浓度OD600在0.4～0.8，获得侵染菌液，备用；

3)准备外植体

选取可食用时期到接近成熟时期的绿色莲蓬，所述的绿色莲蓬在采收后21天以内进行处理，剥出莲子，选择果皮全部或部分呈现绿色的莲子，将莲子用质量分数为10-20％次氯酸钠溶液消毒10-30min，无菌水冲洗；

在无菌环境中除去水分，剥开莲子，分离出莲子的未成熟胚，除去两片子叶，使胚尖露出并创伤胚尖，得到胚尖外植体；

4)侵染、共培养

将获得的胚尖外植体放入待侵染菌液中，超声处理2～4min，后摇床侵染15-120min，放入CAB培养基中共培养3～4天，观察侵染效果，其瞬间表达率在50％以上；所述CAB培养基以MSB培养基为基本培养基，添加了葡萄糖25-35g/L，乙酰丁香酮50-500μM和半胱氨酸50-500mg/L；所述MSB培养基是按照MS培养基的无机盐成分配比、B5培养基的有机盐成分配比配制而成。

2.根据权利要求1所述利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，其特征在于，所述创伤胚尖指用解剖刀在胚尖上纵划。

3.根据权利要求1所述利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，其特征在于，步骤4)中，超声处理时，功率为100W；所述侵染液的组成为1/2MS培养基，添加了葡萄糖15-25g/L和蔗糖5-15g/L。

4.根据权利要求1-3任一项所述利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的绿色莲蓬在采收后4天以内进行处理。

5.根据权利要求4所述利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的绿色莲蓬采收后保存温度为2-8℃。

6.根据权利要求1所述利用未成熟莲胚进行瞬间表达的方法，其特征在于，所述外源基因为可在植物中表达的报告基因。