[发明专利]基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法

权利要求书

1.基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

101)筛选标准株系步骤：从相应海区采集目标有害藻华水样，用毛细管分离进行分离纯化并在控制条件下培养，对藻株进行形态学分析确认其形态分类学地位；其中通过从GenBank数据库检索、下载相应亲缘关系的物种信息，从分子进化分析角度以确定采集到的藻华水样的分类学地位；

102)基因信息采集步骤：扩增步骤101)采集到的藻华水样的rDNA序列，进行同源检索和比对分析，并利用其高变区和保守区来分别进行种特异性和通用引物的设计和筛选；

103)建立定量标准步骤：利用相应海区分离得到纯培养目标藻株进行基因组DNA的提取和定量分析，建立目标藻株细胞数量和核酸浓度的关系；用核酸进行qPCR，建立核酸浓度与Ct值的关系；并进一步绘制目标藻株细胞浓度与Ct值的标准曲线，求得定量回归曲线；从相应海区的有害藻华爆发海区采集现场水样，利用实验室优化的检测技术对其中的有害藻华藻进行qPCR定量分析，同时对样品中的目标有害藻华藻进行镜检计数，比较两种检测方法的差异性以及相关性，建立镜检计数和qPCR计数之间的回归关系，以此建立定量检测标准；

104)高通量检测步骤：通过对步骤102)中藻华水样的rDNA序列中的多个通用区段的比较测试，比对选择不同生物信息学数据库，选取可以得到目标藻的种类最多的靶基因的测序区段与生物信息学数据库，从而反映现场样品有害藻类类群与藻类的相对丰度；

105)判定步骤：利用步骤103)建立好的定量检测标准，拟合经步骤104)获得的高通量分析结果，从而实现高通量测序的可定量化。

2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，其特征在于：rDNA序列包括SSU rDNA、LSU rDNA和ITS区段。

3.根据权利要求2所述的基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，其特征在于：rDNA扩增测序得到序列后，进行blast检索，筛选出与其序列相似性在95％以上的序列，然后将序列下载后，通过序列分析软件对序列进行比对；保守区为序列98％以上全部相同。

4.根据权利要求2所述的基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，其特征在于：采用CTAB法提取有害藻华种的总基因组rDNA，用通用引物对SSU rDNA、LSU rDNA和ITS进行PCR扩增，对其测序后，将得到的序列用于针对于目标有害藻的特异性引物设计，通过qPCR进行验证以及筛选，得到效率最高专一性最强的引物序列；

将最强的引物序列用于目标有害藻华的扩增中，并比对所有的SSU rDNA、LSU rDNA和ITS序列，筛选出最高效的探针序列，即筛选能够扩增出目标藻而且Ct数值较低的引物。

5.根据权利要求2所述的基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，其特征在于：将blast检索出的所有序列进行比对分析，将高变区作为检测靶标区域，并设计通用引物用于高通量检测，以得到更多有害藻华种序列。

6.根据权利要求1所述的基于高通量测序的有害藻华种分子快速检测方法，其特征在于：还包括修正步骤，其包括建立定量标准步骤和高通量检测步骤；

建立定量标准步骤的修正是将采集的样品，一部用戊二醛或者鲁格试剂固定用于镜检，通过直接计数法得到各目标有害藻华藻的细胞浓度；一部分采用微孔滤膜过滤法收集藻细胞用于总rDNA的提取；用各个目标有害藻的特异性引物进行qPCR分析，获得的Ct值，用定量回归方程对各种有害藻华藻进行精确定量；同时比较qPCR定量与常规镜检的结果差异，以修正定量标准；

高通量检测是利用筛选的通用引物，对采集的样品进行高通量测序分析，得到各目标有害藻华的相对丰度，通过选取已用qPCR标定的某种或多种有害藻华原因种作为内参种，换算不同样品中多种目标有害藻华种在现场样品中的丰度，并对比采集的样品镜检结果，进行现场样品与高通量检测的结果差异，以修正高通量检测数据。