[发明专利]猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明涉及一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法，主要包括包括SS‑2引物探针混合液、通用引物混合液、SS‑2PCR反应液、SS‑2引物探针混合液、SS‑2阴性对照、SS‑2阳性对照和SS‑2定量标准品。采用该试剂盒可以实现猪链球菌2型毒力基因的胞外因子epf、溶菌酶释放蛋白mrp和溶血素sly基因的定量检测。试剂盒的检测灵敏度高，最低检测限为1.0×10³copies/mL；定量线性范围广，可对1.0×10³copies/mL～1.0×10¹⁰copies/mL的猪链球菌2型的3种毒力基因准确定量；特异性强，与其他细菌和猪常见病毒无反应；重复性好，批内和批间变异系数均小于5％；稳定性强，反复冻融8次后1.0×10³copies/mL的最低检测限参考品100％检出，非常适用于猪病常规疫情监测和猪血来源的生物制品对猪链球菌的检测需求。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪链球菌是猪的常见病原体，猪链球菌病是多种链球菌引起猪的一类疾病的总称，根据菌体表面荚膜多糖的差异，将其分为35个血清型(1-34型及1/2型)，其中以2型分布最普遍，致病力也最强，1型、7型以及9型则次之。其中由猪链球菌2型引起的疾病是一种重要的人畜共患病，该病原可使猪产生脑膜炎、关节炎、心内膜炎、肺炎、败血症等多种病症甚至可引起急性死亡，同时还可感染人并致人死亡。

猪链球菌的致病力与毒力因子密切相关，目前已知的猪链球菌毒力基因主要有溶血素(sly)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)和荚膜多糖(cps)等。sly在猪链球菌粘附和裂解Hep-2细胞过程中发挥了重要作用，产生溶血素的猪链球菌活菌及培养上清和纯化的溶血素均能导致人脑微血管内皮单层细胞产生病变，说明猪链球菌溶血素是一种重要的毒力基因。mrp和epf猪链球菌2型毒力强弱的重要指标，研究认为根据mrp和epf的有无，猪链球菌2型存在3种表型：MRP⁺EPF⁺、MRP⁺EPF^-和MRP^-EPF^-，人工感染小鼠和猪的试验结果表明MRP⁺EPF⁺可致猪产生典型脑炎、多发性关节炎和多发性浆液炎等症状，MRP⁺EPF^-菌株引起的疾病较为温和，MRP^-EPF^-菌株则无致病性。猪血浆生物制品越来越多的被应用于疾病的治疗和康复中，对猪血清中猪链球菌2型epf、mrp和sly 3种毒力基因的检测为生物制品的生物安全性和使用安全性提供了重要的保障。

目前关于猪链球菌2型毒力基因的检测所公布的方法有基于琼脂糖凝胶电泳法，如专利申请号：CN200710067487.5和CN201010119005.8所公布的琼脂糖凝胶电泳检测均采用多重PCR后琼脂糖凝胶电泳检测的方法，检测灵敏度相对较低，可能导致假阴性漏检，但是由于实验操作过程比较多存在的气溶胶污染所导致的假阳性，不能对病毒含量定量检测。又如专利申请号：CN200610109571.4、CN200610109569.7均采用单重荧光PCR的方法分别对猪链球菌2型mrp和epf基因进行检测，不能定量病毒含量，操作费时。再如专利申请号CN201610255090.8公布了一种同时检测猪链球菌通用型和猪链球菌2型双重荧光定量PCR引物和试剂盒，仅针对猪链球菌2型检测，无法检测是否含有或者含有何种毒力基因，不能为猪链球菌流行病学研究提供帮助，更无法进行定量检测。