[发明专利]猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，包括SS-2引物探针混合液和通用引物混合液，其特征在于：

SS-2引物的核苷酸序列如下所示：

引物epf-F：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGGTCAGCCACTCTCACACAAGATG-3’，(SEQ ID NO：1)，

引物epf-R：

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCCAGTGGCATCCGTCACTTTAAT-3’，(SEQ ID NO：2)，

引物mrp-F：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGCCAGAAACAGACCGTCCAAA-3’，(SEQ ID NO：3)，

引物mrp-R：

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCCATTTGTTCCTGGTGTCGTTG-3’，(SEQ ID NO：4)，

引物sly-F：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGATGGACGCTCTATGTTCATCAAG-3’，(SEQ ID NO：5)，

引物sly-R：

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTTGATACTCAGCATTGCCACTAA-3’，(SEQ ID NO：6)；

SS-2正反链特异性引物的5’端分别连接一段通用引物核苷酸序列，所述的通用引物核苷酸序列如下所示：

引物UP-F：

5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG-3’，(SEQ ID NO：7)，

引物UP-R：

5’-CTACACGACGCTCTTCCGATC-3’，(SEQ ID NO：8)。

SS-2探针的核苷酸序列如下所示：

探针epf-P：5’-CCAGCTAGGTCTCCTGCTCCCCAA-3’，(SEQ ID NO：9)，

探针mrp-P：5’-ACCCATTTGACCCAACAGAGCCAG-3’，(SEQ ID NO：10)，

探针sly-P：5’-AGGAGTACCCAAGTTCAAGCCGCA-3’，(SEQ ID NO：11)；

探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、ROX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ1和BHQ2中一种；且探针epf、mrp和sly的5’端标记的荧光基团均不相同。

2.根据权利要求1所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：还包括SS-2PCR反应Buffer、SS-2酶系、SS-2阴性对照、SS-2阳性对照和SS-2定量标准品。

3.根据权利要求2所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的SS-2阳性对照维含有确定拷贝数的epf、mrp和sly的3种基因的重组质粒；SS-2定量标准品为含有不同拷贝数的epf、mrp和sly的3种基因的重组质粒；所述的SS-2酶系为热启动Taq DNA聚合酶和dNTPs的混合液。

4.根据权利要求1所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：epf、mrp和sly 3种毒力基因探针序列的5’端分别标记FAM、VIC、ROX荧光素，探针序列3’端分别标记BHQ1、BHQ1和BHQ2淬灭基团。

5.根据权利要求1或2或4所述的猪链球菌2型毒力基因多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：epf基因引物浓度50nmol/L，探针浓度100nmol/L；mrp基因引物浓度50nmol/L，探针浓度160nmol/L；sly基因引物浓度50nmol/L，探针浓度80nmol/L；通用引物浓度400nmol/L。