[发明专利]柳杉非生物胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用

说明书

本发明公开了柳杉非生物胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用，属于植物分子生物学技术领域。上述非生物胁迫包括干旱胁迫，热害胁迫，低温胁迫和盐胁迫，本发明筛选并设计了15条候选内参基因，通过5种算法(delta‑CT、geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder)评估候选基因的稳定性，获得了适用于柳杉各非生物胁迫下荧光定量内参基因，并设计了内参基因的实时荧光定量PCR引物，该引物特异性强，扩增效率高，能够大大的提高采用实时荧光定量检测柳杉基因时的检测效率，并提高了检测结果的可信度。

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，具体涉及柳杉非生物胁迫下荧光定量内参基因及其专用引物和应用，其中非生物胁迫包括干旱胁迫，热害胁迫，低温胁迫和盐胁迫。

背景技术

柳杉(Cryptomeria fortunei Hooibrenk)，又名长叶孔雀松，为杉科柳杉属乔木。非生物胁迫因子如干旱、热害、低温、盐害等作用于植物时，会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应。然而现在关于柳杉非生物胁迫下基因的研究还未曾有过报道。柳杉非生物胁迫情况下基因表达的差异的研究过程中，涉及到运用实时荧光定量技术分析和验证基因的表达水平，需要稳定可靠的内参基因，因此筛选柳杉非生物胁迫条件下稳定表达的内参基因是实时荧光定量结果准确的关键因素。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的第一技术问题是提供柳杉非生物胁迫下荧光定量内参基因；本发明所要解决的第二技术问题是提供柳杉非生物胁迫下荧光定量内参基因的专用引物；本发明所要解决的第三技术问题是提供上述内参基因或专用引物在柳杉荧光定量中的应用。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

柳杉非生物胁迫下荧光定量内参基因，非生物胁迫包括干旱胁迫、热害胁迫、盐胁迫和低温胁迫。

进一步的，柳杉干旱胁迫下荧光定量内参基因，为CYP和HSP70基因，CYP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；HSP70基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的柳杉干旱胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，

CYP基因的引物序列如下：

CYP正向引物：5’-TCTCGGGCAGCATTTCACGC-3’；

CYP反向引物：5’-AGCCGAAACTGGCGCCAACA-3’；

HSP70基因的引物序列如下：

HSP70正向引物：5’-AACGCAAGGGCTTTGAGAA-3’；

HSP70反向引物：5’-ACCTGGCACGGGTTATGGT-3’。

所述的柳杉干旱胁迫下荧光定量内参基因在柳杉荧光定量中的应用。

所述的柳杉干旱胁迫下荧光定量内参基因的专用引物在柳杉荧光定量中的应用。

进一步的，柳杉热害胁迫下荧光定量内参基因，为CYP和UBC基因，CYP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；UBC基因的核苷酸序列如SEQ D NO.3所示。

所述的柳杉热害胁迫下荧光定量内参基因的专用引物，

CYP基因的引物序列如下：

CYP正向引物：5’-TCTCGGGCAGCATTTCACGC-3’；

CYP反向引物：5’-AGCCGAAACTGGCGCCAACA-3’；

UBC基因的引物序列如下：

UBC正向引物：5’-CTCGCAGAATCATAAAGGAAACAC-3’；