[发明专利]一种检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测LRRK2基因2385位点多态性的引物和探针及试剂盒。利用1对LRRK2基因2385位点特异性引物，扩增人类LRRK2基因2385位点基因片段，设计特异性Taqman MGB探针，即在一个反应体系中通过两种不同通道检测一个SNP位点。在反应体系含有不同基因型模板的情况下，随着PCR扩增过程，释放不同的荧光信号。利用仪器对PCR过程中相应通道的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。本发明在保证检出特异性和灵敏度的基础之上，实现便捷、快速、高效地检测，减少检测操作步骤、缩减检测反应时间的同时减低了生产成本和检测成本，有利于临床检测分析应用。

技术领域

本发明涉及一种检测LRRK2基因2385多态性的引物和探针及试剂盒，属于基因多态性检测技术领域。

背景技术

人LRRK2基因位于染色体12p11.2–q13.1，长约144kb(含有7581个碱基对)，含有51个外显子，编码一个由2527个氨基酸组成的蛋白质(分子量为275KDa)，LRRK2蛋白(又称为dardarin蛋白或富亮氨酸重复序列激酶2)，属于ROCO蛋白家族。

帕金森病(PD)是目前世界上第二大进行性神经退行性疾病。富亮氨酸重复激酶2(LRRK2)基因的某些突变和风险变异在PD患者中非常常见，约占家族性和散发性PD的5-15％。到目前为止，已经发现了近100个LRRK2变种。其中，G2019S、R1628P和G2385R在传统上受到了很大的关注。这些变种各有不同的地理分布。G2019S是欧洲/西亚人群最常见的变异，在欧洲人群中占家族性PD病例的3％，在德系犹太人(AJ)中占近14％，而在亚洲人群中极少见。G2385R、R1628P和A2385V在东亚人群中更为常见，其中G2385R、R1628P两个突变在亚洲帕金森病人群中占5-9％，并且这两个突变都增加了帕金森病2倍的风险。而A2385V可提示亚洲人群早发型帕金森病的风险。

携带LRRK2 G2385R突变的帕金森病患者较非携带者更常有帕金森病家族史，病程更长，MMSE评分更高。不仅在10％的PD病例中发现了G2385R变异，而且在3-4％的未发病人群中也发现该变异。LRRK2基因Gly2385Arg突变位点仅在亚洲人群中被发现。该位点位于LRRK2基因第48外显子的WD40结构域，使第7153号核苷酸G变成A，相应密码子GGG变成了GGA。当出现Gly2385Arg变异时，具有亲水性并带有正电荷的精氨酸取代了疏水性的甘氨酸，从而改变了WD40结构域表面电荷及其构象，进而与其他蛋白质发生新的相互作用，同时阻止与原来结合甘氨酸的蛋白质的相互作用，最终影响LRRK2蛋白的功能表现。目前已有多项研究发现LRRK2基因Gly2385Arg位点与散发性帕金森病相关。

PD前驱期是指PD神经退行性变的症状或体征，不伴有典型的运动帕金森症。遗传学发现，结合年龄、环境危险因素和其他诊断标记物检测，在前驱性PD的诊断中发挥重要作用。LRRK2 G2385R在亚洲人群中是一个危险因素，包括中国人和非中国人。这可能有助于进一步探索帕金森病的病因学和生物标志物，特别是在亚洲人群中。

现有技术存在如下缺陷和不足：

现有市面上无上市试剂盒对其进行检测；我们的试剂盒特异性筛选ARMS引物与MGB探针，特异性非常强，结果判读无需计算，清晰明确。

现有技术只能通过测序法进行检测，测序所需机器和耗材昂贵，并且对操作人员素质要求较高，普通医院几乎无测序服务，不利于基因位点的筛查，而我们的基因检测试剂所用的是荧光定量PCR法，能够兼容目前几乎所有的荧光定量PCR仪器，并且在新冠疫情中荧光定量PCR技术发挥了不可替代的作用，成为检测行业的主流，应用前景十分广阔。

在临床操作层面，目前相关基因测序没有专门的收费标准，由于高通量测序适用于多个位点同时检测，单独检测一个基因位点成本很高，因此一般来说是按照多个位点进行收费，病人经济承受压力较大。而我们的荧光定量PCR检测试剂则没有这种情况，一个位点就是按一位点的价格进行收费。