[发明专利]突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法

说明书

本发明公开了突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法，该突变的核酸的序列如SEQ IDNO：1所示；本发明通过ep‑PCR技术快速获取突变漆酶基因，以形成庞大的突变体文库；同时在蛋白N‑末端构建组氨酸标签，便于后续利用标签进行突变体菌株的高通量筛选，实现了漆酶基因在毕赤酵母中的异源表达和改造，重组毕赤酵母突变菌株酶蛋白的比活力提高约2倍，降低该漆酶的使用成本，提升重组毕赤酵母菌的工业应用潜力。

技术领域

本发明涉及漆酶的蛋白质工程改造和异源表达，属于漆酶基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法。

背景技术

漆酶(EC1.10.3.2)是研究历史悠久的工业酶之一，它属于蓝色多铜氧化酶家族(Blue multicopper oxidases，MCOs)，因其催化底物谱广、副产物生态友好等优点，已在复合材料生产、污水处理以及生物医学诊断等多方面得到广泛应用，目前，工业漆酶主要来源于细菌和真菌，然而，野生酶的自然特性基本不符合工业应用标准，为此通过现代生物技术对漆酶的改造尤为重要。

蛋白质的定向进化技术是蛋白质改造的有效方法之一，通过定向进化技术进行蛋白质工程改造已成为学术界和工业界(主要用于生物催化)调整酶学性质的常用方法，据不完全统计，包括淀粉酶、碱性蛋白酶、和纤维素酶等在内的多种酶得到了不同改造，有关漆酶定向进化研究主要包括催化效率、有机溶剂的耐受性、最适催化pH和氧化还原电势的提高，然而，有关漆酶高比活力的定向进化研究甚少，因此，对漆酶高比活力的定向进化研究具有重大研究意义和实际应用价值。

为提高漆酶蛋白的定向进化改造效率，一般需要对目标蛋白进行重组表达，目前，漆酶重组蛋白表达系统可分为以大肠杆菌为代表的原核表达系统、以毕赤酵母为代表的子囊真菌表达系统和以里氏木霉为代表的丝状真菌表达系统，其中，以里氏木霉为代表的丝状真菌表达系统主要用于漆酶的高效表达，一般不用于蛋白质工程改造中；以大肠杆菌为代表的原核表达系统主要用于细菌漆酶的重组表达；而以毕赤酵母为代表的子囊真菌表达系统具有生长快、培养方便、遗传操作成熟，同时还可以对表达蛋白进行加工、修饰和折叠等特点，被广泛用于真菌漆酶的重组表达和改造。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的真菌表达系统不能用于漆酶的蛋白质工程改造问题，提供突变的核酸、表达载体和制备高比活力漆酶突变体及其方法。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种突变的核酸，该突变的核酸的序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明第二方面提供一种表达载体，该表达载体插入有前述第一方面所述的突变的核酸。

本发明第三方面提供一种制备高比活力漆酶突变体的方法，该方法包括，使用权利要求2所述的表达载体转化酵母细胞，得到转化后的酵母细胞。

优选地，所述方法包括：

(1)提取漆酶基因模板：对Escherichia coli-JM109-T1-pie5菌株进行培养、收集，以质粒提取试剂盒操作说明提取质粒，得到漆酶基因模板；

(2)突变基因克隆：以PIE5-F/PIE5-R/His-PIE5-F为引物，采用易错PCR技术对所述漆酶基因模板进行突变、扩增，得到突变LacMut基因；

(3)表达载体构建：通过酶切连接法，将所述突变LacMut基因插入到pPIC9K启动子AOX1下游，将pPIC9K-LacMut表达载体转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，得到JM109-pPICK-LacMut菌落；

(4)重组菌株的获得：使用限制性内切酶Sac I对JM109-pPICK-LacMut质粒线性化，通过电转化将线性化表达载体转入宿主毕赤酵母GS115中；