[发明专利]一种用于人粪便病原微生物基因组建库的试剂盒和测序方法

说明书

本发明公开了一种用于人粪便病原微生物基因组建库的试剂盒和测序方法。本发明的用于人粪便中的病原微生物基因组建库的核酸提取试剂盒，包括：核酸释放剂Lysis A、增强剂Lysis Enhancer、去抑制剂IRT、结合液Binding Buffer、洗涤液1和洗涤液2。本发明对核酸提取环节进行了优化，所提DNA纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下，下游试验的正常进行。同时对PCR扩增条件进行优化，降低了DNA建库的起始量，提高了建库成功率，降低了PCR扩增偏向性，缩短了建库周期，克服了现有建库方法对模板起始量要求高，容易出现偏向性，建库周期长等痛点。

技术领域

本发明属于DNA提取和建库领域，具体涉及一种用于人粪便病原微生物基因组建库的试剂盒和测序方法。

背景技术

传统的诊断病人感染性疾病的临床模式是由医生制定鉴别诊断，然后进行一系列测试，试图找出病因。临床样品中病原体常规检测的范围包括鉴定培养中生长的微生物(例如，通过生化表型检测或基质辅助激光解吸/电离(MALDI)飞行时间质谱法)，检测生物体特异性生物标记物(例如抗原用乳胶凝集试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)抗体试验或用PCR对单个试剂进行核酸试验。这些通常包括与确定的临床综合征有关的最常见病原体，如脑膜炎和脑炎、急性呼吸道感染、败血症或腹泻病。

虽然分子诊断分析为诊断最常见的感染提供了一种相当经济有效和快速的方法(通常＜2h的周转时间)。然而，目前使用的几乎所有常规微生物试验一次只能检测一种或有限的病原体，或者要求从临床样本中成功培养微生物。

幸运的是，全新的病原学诊断技术mNGS(宏基因组学二代测序)将有望解决这一难题，mNGS是一种对临床样本中的所有核酸进行测序，然后与各个物种的基因组序列对比，从而寻找可能病原体的方法。mNGS不仅可以大大缩短标本周转时间，还能及时为临床提供准确有利的诊疗依据。

目前，mNGS作为最重要的分子生物学分析方法之一，不仅为遗传信息的揭示和基因表达调控等基础生物学研究提供重要数据，而且在基因诊断和基因治疗等应用研究中也发挥着重要的作用。自2005年以来，以Roche公司的454技术、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的高通量测序技术的相继诞生和发展。mNGS实现测序，通常通过下面三个步骤：1)通过PCR扩增技术获得含待测定区域的核酸分子；2)在含待测定目标区域的核酸分子的两端分别连接不同的接头分子，获得测定文库；3)通用引物扩增连接产物，达到测序要求的量。

但是，对于一些珍贵的样本往往提取获得的核酸量非常有限，常常经过去宿主等步骤处理，样本核酸量无法满足上机要求，通过PCR扩增，增加PCR循环数，加重扩增偏向性，导致对于部分GC含量高的细菌的鉴定，出现严重问题，菌种丰度比例严重失衡。同时，部分建库试剂盒存在周期过长等问题。

鉴于此，现有技术中仍亟需一种新的快速的适用于微量临床建库方法简化实验步骤，提高建库效率。

发明内容

本发明提供一种用于人粪便中的病原微生物基因组建库的试剂盒和测序方法，本发明对核酸提取环节进行了优化，所提DNA纯度高、得率高，以保证即使在样本量有限的情况下，下游试验也能正常进行。同时对PCR扩增条件进行优化，降低了DNA建库的起始量，提高了建库成功率，降低了PCR扩增偏向性，缩短了建库周期，克服了现有建库方法对模板起始量要求高，容易出现偏向性，建库周期长等痛点。

本发明的第一个目的是提供一种用于人粪便中的病原微生物基因组建库的核酸提取试剂盒，其包括：核酸释放剂Lysis A、增强剂Lysis Enhancer、去抑制剂IRT、结合液Binding Buffer、洗涤液1和洗涤液2；

所述的核酸释放剂Lysis A包括20mM～40mM EDTA、40mM～80mMTri-HCl、2％～5％PVP-40(质量分数)、溶剂为DEPC水，PH值为9-10；