[发明专利]一种Kabuki综合征类脑器官模型的制备方法及其应用

权利要求书

1.GSK-3抑制剂在制备治疗Kabuki综合征药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述GSK-3抑制剂包括Chir99021；

优选地，所述的Chir99021的结构式如式1所示：

优选地，所述Kabuki综合征为KMT2D突变所导致的Kabuki综合征；

优选地，所述Kabuki综合征为KMT2D缺失的Kabuki综合征；

优选地，所述的药物包含有效量的GSK-3抑制剂；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的药用载体；

更为优选地，所述药用载体包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、表面活性剂和润滑剂中的一种或几种。

3.GSK-3抑制剂在制备回复GABA能神经元的药物中的应用；

优选地，回复Kabuki综合征患者的GABA能神经元；

优选地，所述GSK-3抑制剂包括chir99021；

优选地，所述Kabuki综合征为KMT2D基因突变所导致的Kabuki综合征；

优选地，所述Kabuki综合征为KMT2D基因缺失的Kabuki综合征。

4.一种载体，其特征在于，所述载体包含：(1)与待改变的转化区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自KMT2D基因功能结构域SET区域上游1499bp同源序列；(2)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自KMT2D基因功能结构域SET区域下游1657bp同源序列。

优选地，所述5’臂尾端接了TAGTAATGA终止密码子终止转录；

优选地，所述5’臂和3’臂之间还含有PGK-Puro或PGK-Hygro抗性筛选标志；

优选地，所述5’臂的序列如SEQ ID NO:11所示；

优选地，所述3’臂的序列如SEQ ID NO:12所示；

优选地，含有PGK-Puro的载体的序列如SEQ ID NO:21所示；

优选地，含有PGK-Hygro的载体的序列如SEQ ID NO:22所示；

优选地，所述载体用于敲除KMT2D；

优选地，所述载体用于对KMT2D-SET区域进行敲除；

优选地，所述载体为靶向载体。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求4所述的载体。

6.权利要求3所述的载体或权利要求5所述的细胞在制备大脑的类器官中的应用；

优选地，所述大脑类器官为Kabuki综合征的大脑的类器官；

优选地，所述大脑的类器官为哺乳动物的大脑类器官；

优选地，所述哺乳动物为人。

7.一种获得大脑的类器官的方法，其特征在于，所述方法包括在胚胎干细胞中，通过载体同源重组，用两种不同的筛选标志，分别替换双等位KMT2D，进行双等位KMT2D的敲除；

优选地，所述靶向载体为权利要求4所述的载体；

优选地，所述两种不同的筛选标志为PGK-Puro和PGK-Hygro抗性筛选标志；

优选地，所述的大脑的类器官为Kabuki综合征的大脑的类器官；

优选地，所述的大脑的类器官为哺乳动物的大脑类器官；

优选地，所述所述哺乳动物为人；

优选地，所述双等位KMT2D结构域被替换；

更为优选地，所述结构域为外显子51至54之间区域；

优选地，所述敲除还使用了sgRNA；

优选地，所述sgRNA靶向的基因为KMT2D基因；

优选地，所述sgRNA靶向KMT2D-SET区域；

优选地，所述sgRNA包括如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的sgRNA。

8.权利要求7所述的方法制备得到的大脑的类器官；

优选地，所述的大脑的类器官为哺乳动物的大脑类器官；

优选地，所述所述哺乳动物为人；

优选地，所述的大脑的类器官中的GABA能神经元的过量表达。