[发明专利]检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针组合及试剂盒

说明书

本发明是关于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种可快速检测猪伪狂犬病病毒的重组酶介导等温扩增方法，具体包括检测过程中使用的引物对和探针、试剂盒。本发明所述检测猪伪狂犬病病毒的RAA引物对和探针以及相应的试剂盒，可以实现对猪伪狂犬病病毒的快速检测，具有简单快速、反应灵敏、特异性好的特点，扩增所得产物可以通过便携式蓝光仪进行肉眼可视化的结果判断，可以真正实现便携式快速核酸检测。

技术领域

本发明是关于动物疫病检测技术领域，具体涉及一种可快速检测猪伪狂犬病病毒的重组酶介导等温扩增(Recombinase-aided amplification，RAA)方法，具体包括检测过程中使用的引物对和探针、试剂盒。

背景技术

猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的猪的急性传染病，该病在猪中呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎和木乃伊胎、公猪不育、育肥猪呼吸困难、生长停滞、新生仔猪大量死亡等症状，是严重危害世界养猪业的主要疫病之一。据报道，猪是本病原唯一的自然宿主和储存宿主，猪只不分大小和性别均对伪狂犬病病毒易感，而病猪和带毒猪是最主要的传染源，由感染猪排出的病毒又能通过多种途径感染其他动物，且猪伪狂犬病病毒感染的耐过猪都存在病毒的潜伏感染，并成为病毒携带者。目前，猪伪狂犬病对养猪业的危害极大，对于该病的防控，在一些欧美国家，通过使用标记疫苗和相应的鉴别诊断方法，很好地控制和根除了该病症，但在多数发展中国家，该病仍然频繁发生，给养猪业造成了巨大经济损失。

据研究，净化和根除猪伪狂犬病核心技术是基因缺失(标记)疫苗和鉴别诊断方法的研制与应用，并结合生物安全防控等措施。其中，gE基因是决定PRV毒力至关重要的基因之一，它在PRV感染细胞以及病毒的释放方面有重要作用，但它也是病毒复制的非必需基因。由于gE基因的缺失降低了PRV的毒力，因此在减毒PRV疫苗株中普遍缺失gE基因。目前，伪狂犬病疫苗毒株大多数是gE基因缺失的弱毒疫苗，因而可以通过检测gE基因实现对疫苗免疫猪和野毒感染猪的鉴别诊断，为伪狂犬病的净化提供理论依据。因此，为了降低猪伪狂犬病给养猪业带来的巨大经济损失，更好的预防、控制和根除猪伪狂犬病，需要开发一种快速、简便、灵敏、低成本、可靠的诊断方法。

目前，针对PRV核酸、抗原和抗体的多种检测方法已被用于对该病的诊断与防控。这些方法通常包括从感染动物的组织样本中分离病毒，对组织切片进行免疫荧光分析，以及血清学分析等。其中，血清学检测主要包括病毒中和、乳胶凝集或酶联免疫吸附试验(ELISA)等；病原学诊断方法通常使用病毒分离、动物接种、聚合酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR(qPCR)、液滴数字PCR、纳米颗粒辅助聚合酶链反应(NanoPCR)和环介导等温扩增(LAMP)等。虽然这些检测方法在猪伪狂犬病的诊断中都发挥了重要的作用，但常规诊断方法存在操作复杂、耗时，且需要经验丰富的技术人员、复杂和昂贵的仪器设备等缺点，不利于猪伪狂犬病的快速诊断，也不适合在资源有限的环境、基层和现场即时检测(point ofcare testing，POCT)。因此，建立一种简单快速、灵敏、特异的猪伪狂犬病病毒的检测方法，对该病的诊断、防控和根除具有重要意义。

重组酶介导的等温扩增反应(Recombinase Aided Amplification，RAA)是一种新型的等温体外核酸扩增技术，因其快速、且不需要昂贵的仪器，以及操作简单等特点，已被广泛用于对各种病原微生物的快速诊断。RAA技术主要依赖于三种蛋白：单链DNA结合蛋白(能和单链DNA结合，防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解)、重组酶(能与引物形成复合物，促进引物与模板DNA的同源序列配对，启动DNA复制)和DNA聚合酶(用于扩增和延伸)。RAA反应在37-42℃条件下30min内即可得到与传统PCR反应相当的扩增产物，进一步结合exo探针技术和核酸外切酶III，还可以实现数据的实时读取，具有灵敏度高、特异性强、能实现现场快速检测等特点。另外，由于FAM是一种绿色荧光基团，其在蓝光下可以被激发出绿色荧光，因此可以结合便携式蓝光仪器对RAA扩增产物进行可视化的判断，适用于资源有限的环境、基层和现场即时检测，在核酸快速检测方面具有巨大的应用前景。

发明内容