[发明专利]一种建立于dCas9工程化修饰蛋白及生物膜层干涉技术基础上的检测核酸的方法

说明书

本发明公开了建立于dCas9工程化修饰蛋白及生物膜层干涉技术基础上的检测核酸的方法。所述CRISPR‑BLI检测芯片包括：BLI感受器和固定在BLI感受器上的CRISPR探针；所述CRISPR探针由biotin‑dCas9‑Halo功能化蛋白和sgRNA复合而成；所述biotin‑dCas9‑Halo功能化蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。基于CRISPR‑BLI检测芯片，本发明构建出一种实时、快速、序列特异识别的检测核酸新方法；其中，目标DNA被固定于芯片表面的dCas9‑Halo‑biotin特异性捕获，改变芯片表面的光学性质，通过膜层干涉对芯片表面检测对DNA进行快速相应，可在9分钟内实现体系中840pmol/L核酸的特异性检出，为高通量输出快速准确的核酸检测结果提供有效手段。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种建立于dCas9工程化修饰蛋白及生物膜层干涉技术基础上的检测核酸的方法，特别是涉及一种基于biotin-dCas9-Halo功能化蛋白的CRISPR-BLI检测芯片及其应用。

背景技术

对病理学相关靶序列标志物的明确促进了核酸检测方法和分子诊断的发展。核酸检测在疾病、食品安全、环境监测等领域有着广泛的应用。其中一些方法在临床环境中发挥着关键作用，提供指导治疗的精确信息，监测患者状况、改善预后。目前广泛应用于靶序列检测的方法有聚合酶链反应(PCR)、基因测序和原位杂交。然而，这些类核酸检测方法大多数较为耗时，需要繁琐的样品处理和试剂配置、探针标记或昂贵仪器支持。因此，发展更适用于临床分子诊断的快速、简便的策略十分迫切。

生物层干涉技术(Biolayer interferometry，BLI)是一种实时、灵敏、快速的分析技术，通过监测BLI传感器上光学层厚度的变化来检测生物分子间的相互作用。BLI目前已经广泛地应用于抗原抗体、药物筛选等重要的医疗卫生领域，在分析生物分子间的相互作用、结合率、解离率和结合特异性等方面具有优势，被许多研究证实为一种快速、敏感、便捷的检测手段。因此，BLI技术作为一种靶向核酸检测方法具有很大的潜力。

CRISPR/Cas是一系列在单链RNA(sgRNA)引导下特异性识别靶序列的核酸酶，核酸。这种基因“魔剪”已经扩展到几乎所有的基因组目标，并被视为一种新型的核酸感受器受到越来越多的关注。dCas9作为CRISPR/Cas9的突变体，其RuvC1和HNH结构域中的两个核酸酶活性位点同时发生突变，使其失去核酸酶活力但仍可对核酸特异性识别，因此dCas9可避免了Cas9酶切功能对待检测基因进行剪切等不良作用而作为核酸感受器应用于核酸实现核酸检测中。专利CN107574226A通过利用Ru(bpy)₃²⁺修饰的dCas9和磁性微球构建一种核酸检测技术。但在核酸的实际检测过程中，Ru(bpy)₃²⁺强正电性都会导致核酸的非特异性结合捕获，同时检测过程需要多步骤的处理，这使得检测体系复杂耗时，检测特异性减弱。

但目前还很少见有将dCas9与BLI技术联合检测核酸的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于biotin-dCas9-Halo功能化蛋白的CRISPR-BLI检测芯片及其应用。本发明通过Halo标签生物特性对dCas9-Halo蛋白进行生物素标记，得到一种biotin-dCas9-Halo工程化的修饰蛋白；在此基础上，制备CRISPR探针，并将其固定化到BLI传感器表面获得CRISPR-BLI检测芯片；利用CRISPR-BLI检测芯片对核酸的光学信号响应构建一种实时、快速、特异、高通量的核酸检测方法，在无需扩增的条件下就可对核酸进行检测，方法灵敏度高、特异性好。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种CRISPR-BLI检测芯片，包括：BLI感受器和固定在BLI感受器上的CRISPR探针；