[发明专利]一种建立于dCas9工程化修饰蛋白及生物膜层干涉技术基础上的检测核酸的方法

权利要求书

1.一种CRISPR-BLI检测芯片，其特征在于，包括：BLI感受器和固定在BLI感受器上的CRISPR探针；

所述CRISPR探针由biotin-dCas9-Halo功能化蛋白和sgRNA复合而成；所述biotin-dCas9-Halo功能化蛋白为dCas9-Halo蛋白经生物素定点修饰获得，dCas9-Halo蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述的CRISPR-BLI检测芯片，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQID NO.6所示。

3.权利要求1或2所述的CRISPR-BLI检测芯片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将编码dCas9和Halo标签的基因序列连接到表达载体上，获得重组表达质粒，并转化到大肠杆菌中进行原核表达，分离纯化得到dCas9-Halo蛋白；将dCas9-Halo蛋白进行生物素定点修饰，制备得到biotin-dCas9-Halo功能化蛋白；

(2)将biotin-dCas9-Halo功能化蛋白与sgRNA复合，制备得到CRISPR探针；

(3)将CRISPR探针固定在BLI感受器上，制备得到CRISPR-BLI检测芯片。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，编码dCas9的基因序列如SEQ ID NO.1所示；编码Halo标签的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，对dCas9-Halo蛋白进行生物素定点修饰的方法为：用pH＝7.4的PBS缓冲液将dCas9-Halo蛋白超滤浓缩，使蛋白的终浓度大于或等于1mg/mL；向浓缩后的dCas9-Halo蛋白溶液中加入HaloTag@PGE-Bio tinLigand母液，混匀，室温反应30-90分钟，以pH＝7.4的PBS缓冲液为流动相过除盐柱，除去未反应小分子，收集浓缩修饰后蛋白。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，biotin-dCas9-Halo功能化蛋白与sgRNA复合的方法为：将500μg biotin-dCas9-Halo功能化蛋白超滤浓缩至500～1000μL；取100-250μL的sgRNA加入到浓缩后的biotin-dCas9-Halo溶液中，混合均匀，在37℃条件下孵育复合15-30分钟。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，将CRISPR探针固定在BLI感受器上的方法为：将BLI感受器首先浸入平衡液1中平衡基线60-120秒，然后浸入CRISPR探针溶液中500-900秒，将CRISPR探针固定在BLI感受器上；

所述平衡液1为：含有5-50μg/ml肝素钠、0.1～0.01％BSA、0.01～0.05％Triton X-100、0.01～0.05％Tween-20、0.1～0.5mol/L NaCl、1～5mmol/L MgCl₂、1～5mmol/ml EDTA和0.1～0.01％变性鲑鱼精DNA的0.1M PBS，pH＝6.0-8.0。

8.权利要求1或2所述的CRISPR-BLI检测芯片在如下(1)或(2)中的应用：

(1)检测核酸；

(2)制备检测核酸的产品。