[发明专利]一种单细胞测序筛选脂肪细胞标记分子的方法

说明书

本发明公开了一种利用单细胞测序筛选脂肪细胞标记分子的方法，包括以下步骤：(1)分离软骨组织；(2)分离单细胞并进行裂解；(3)对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA；(4)以cDNA为模板进行PCR扩增，产物纯化，进行Tagmentation反应，完成cDNA测序文库构建；(5)对构建的cDNA文库进行高通量测序；(6)测序结果进行生物信息学分析，寻找脂肪细胞特异性的标记分子。

技术领域

本发明属于生物医学领域，尤其是涉及一种利用单细胞测序筛选脂肪细胞标记分子的方法。

背景技术

骨关节炎是以关节软骨退化、软骨下骨硬化，骨赘形成并伴有关节疼痛、肿胀、畸形及活动障碍的慢性退行性关节病，且多发于膝、髓等负重关节叫。据统计全世界骨关节炎患病率约为15％，其中50岁以上老年人群的发病率达到50％，最终致残率高达53％。我国流行病调查研究发现我国40岁以上人群膝、手、颈、腰关节炎的总患病率则高达46.3％。关节功能的丧失及致残不仅严重影响老年人群的生活质量还加重家庭和社会的经济负担，有效预防该病已成为国内外重大的公共卫生问题。

脂肪细胞可以分泌出一种和关节炎相关的蛋白质，这项发现或许可以帮助开发新型的基因疗法来治疗疾病。膝盖中的脂肪细胞可以分泌一种名为前因子D的蛋白质，其可以产生一种名为因子D的蛋白质，而后者又与关节炎直接相关。因子D是补体系统的一部分，机体的补体系统中含有超过40种蛋白质，其可以帮助机体有效抵御细菌的感染。脂肪在所有的关节中发挥的作用都一样，这就意味着治疗炎性关节炎是可以造福于整个机体的。

因此，若能不断发现脂肪细胞的特异性标记分子及调控因子，从分子水平探讨骨关节炎与脂肪细胞之间的相互作用，可为深刻揭示骨关节炎发病的机制提供更有效的科学依据，同时也能为临床治疗骨关节炎提供新思路和新方法。

我们利用单细胞测序技术在脂肪细胞的单细胞水平上对全转录组进行扩增与测序，在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控的规律，最后利用生物信息学分析技术，从mRNA水平上分析寻找脂肪细胞的特异性标记分子，为骨关节炎的靶向治疗提供新靶点。

发明内容

本发明的目的在于针对上述存在的科学问题，提供一种单细胞测序筛选脂肪细胞标记分子的方法。

本发明的技术方案概述如下：

本发明的单细胞测序筛选脂肪细胞标记分子的方法，包括以下步骤：

1)提取软骨组织；

2)分离单细胞并进行裂解：分离单细胞，加入裂解缓冲液中进行裂解，得到细胞裂解液；

3)对样品的mRNA进行逆转录得到cDNA：使用美国ThermoFisher公司的SuperScript试剂盒构建逆转录体系，对上述步骤2)获得的细胞裂解液进行逆转录，得到cDNA；

4)以cDNA为模板进行PCR扩增，构建测序文库，进行测序：使用美国Illumina公司的NexteraXT试剂盒，按照说明书对上述步骤3)得到的逆转录产物进行扩增和纯化，构建高通量测序文库；完成后将文库送交测序；

5)对测序结果进行生物信息学分析，从mRNA水平上分析寻找脂肪细胞的特异性标记分子。

以上所述步骤1)中，将从软骨组织中提取的细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mRNA水平上寻找其特异的标记分子。

本发明突出的实质性特点和显著的进步是：

通过利用单细胞测序技术，将从软骨组织中提取的脂肪细胞进行单细胞测序，利用生物信息学分析从mRNA水平上寻找其特异的标记分子，为靶向治疗寻找新的靶点提供更为全面、客观、准确的方法。

附图说明

图1为单细胞测序检测软骨组织中细胞亚群。