[发明专利]一种去除核酸检测背景的方法及其应用

权利要求书

1.一种去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述去除核酸检测背景的方法包括：

在扩增引物上连接标记物，扩增目标片段，再将所得扩增产物进行解链；

将所得解链后的扩增产物和连接标记物的扩增引物转移至表面连接探针的基底上，孵育，所述连接标记物的扩增引物与所述解链后的扩增产物结合，所述解链后的扩增产物与所述基底表面的探针结合；

而后，记录所述标记物的运动轨迹，根据所述运动轨迹判定检测信号的种类。

2.根据权利要求1所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述标记物包括表面带有羧基的微球；

优选地，所述微球的直径为0.8～1.2μm，优选为1μm。

3.根据权利要求1或2所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述标记物与扩增引物中的正向扩增引物相连；

优选地，所述正向扩增引物的5’端携带氨基；

优选地，所述标记物与正向扩增引物共价连接；

优选地，所述共价连接包括EDC-NHS反应和/或叠氮-炔基反应；

优选地，所述扩增使用的扩增引物包括未标记的扩增引物和/或所述连接标记物的扩增引物。

4.根据权利要求1～3任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述基底包括玻璃基底和/高分子基底；

优选地，所述探针与所述基底共价连接；

优选地，所述共价连接包括EDC-NHS反应和/或叠氮-炔基反应；

优选地，所述探针与所述基底连接前还包括合成探针的步骤。

5.根据权利要求1～4任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述解链的温度为93～97℃，优选为95℃；

优选地，所述解链的时间为3～7min，优选为5min。

6.根据权利要求1～5任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述记录标记物的运动轨迹前还包括清洗未结合的扩增产物的步骤。

7.根据权利要求1～6任一项所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述记录标记物的运动轨迹的具体步骤为：

将基底置于显微镜下，对基底进行加热，同时通过摄像装置记录标记物的运动轨迹，根据所述运动轨迹进行判定；

优选地，所述加热的温度为30～80℃；

优选地，所述摄像装置包括高速摄像机；

优选地，所述高速摄像机的速率为500～5500fps，优选为5000fps；

优选地，所述记录标记物的运动轨迹的时间为1～5s。

8.根据权利要求7所述的去除核酸检测背景的方法，其特征在于，所述判定的依据为所述标记物在规定时间内的均方位移；

优选地，所述规定时间为0.02～0.05s；

优选地，所述判定的依据为：

在0.02～0.05s内，所述均方位移大于0.02μm²，判定检测信号为未结合分子的背景信号；

在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm²之间，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为扩增产物与探针之间特异性结合的真实信号；

在0.02～0.05s内，所述均方位移在0.005～0.015μm²之间，且均方位移随温度升高至大于0.02μm²，判定检测信号为因碱基错配而非特异性结合的背景信号；

在0.02～0.05s内，所述均方位移小于0.005μm²，且均方位移不随温度升高而增大，判定检测信号为标记物与探针之间非特异性吸附的背景信号。