[发明专利]一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法，属于代谢工程领域。本发明以还原TCA途径和逆己二酸降解途径为基础，通过过表达相关基因进行途径强化以及基因表达水平层面的优化，从而获得了一株具有较大潜力的己二酸生产菌株。本发明对于提高己二酸的产率具有强有力的理论依据，提高了碳源的利用率，减少了二氧化碳的排放，己二酸产量达到0.3g/L，所述方法为其他高附加值有机酸生产菌株的代谢重组提供了方法借鉴。

技术领域

本发明涉及一株通过还原TCA途径生产己二酸的工程菌株及其构建方法，属于代谢工程领域。

背景技术

三羧酸循环(Tricarboxylic acid cycle,TCAcycle)是生物体内最活跃的代谢途径，是脂肪，糖类，氨基酸三大类营养素的代谢枢纽。有氧条件下，生物体主要通过正向的氧化TCA循环完成一系列的酶促反应，在厌氧条件下，逆向的还原TCA途径会被激活来合成细胞所需要的重要原料。相比于氧化TCA循环存在的两步会造成碳原子流失的脱羧步骤，还原TCA循环由于其关联的固碳步骤，碳原子的利用率得到了显著提高。还原TCA途径凭借其较高的理论产率已被大量应用于生产苹果酸，富马酸，琥珀酸等有机酸。

己二酸是一种重要的六碳二元羧酸，已被广泛地用于生产尼龙6,6等工业用品。通过化学法生产己二酸面临严峻的能源匮乏及环境污染等问题，因此寻求绿色的可持续发展的生物合成方法迫在眉睫。半生物法合成己二酸主要包括生物法合成己二酸前体物质以及前体物质通过化学催化转换为己二酸这两个步骤，然而化学催化过程贵金属铂的使用大大增加了生产成本，所以此方法很难适用于大规模的工业化。随着合成生物学及代谢工程的发展，全生物法合成己二酸的策略被大量地报道与应用，例如逆β氧化途径，脂肪酸的ω-氧化，α-酮酸途径等，然而，这些途径大都由于产率低很难得到进一步的放大生产。值得关注的是，目前，通过来源于Thermobifidafusca的逆己二酸降解途径全生物合成己二酸实现了大肠杆菌中己二酸的最高报道产量。

逆己二酸降解途径合成己二酸的两个主要前体物质为琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，其中，琥珀酰辅酶A作为TCA循环的代谢中间产物既可以由氧化TCA途径产生，也可以由还原TCA途径产生。当琥珀酰辅酶A通过氧化TCA途径产生时，由于异柠檬酸转化为α-酮戊二酸和α-酮戊二酸转化为琥珀酰辅酶A均为脱羧步骤，碳原子以二氧化碳形式的排放导致当以葡萄糖为底物进行生物合成己二酸时，己二酸的理论产率仅为54.07％。所以，虽然已有的报道己二酸的实际产率已经达到了理论产率的93％，但较低的理论产率限制了己二酸产量的进一步提高。因此，依赖于生物代谢网络，开发一种致力于提高碳源利用率的工程代谢途径，对于获得己二酸高产菌株具有重要的现实意义。

发明内容

技术问题：

目前通过氧化TCA途径偶联逆己二酸降解途径生产己二酸的理论产率最高仅为54.07％，限制了己二酸产量的进一步提高；合成代谢途径碳源不能被完全利用。

技术方案：

本发明第一个目的是提供一种通过还原TCA途径偶联逆己二酸降解途径生产己二酸的工程菌株。

在一种实施方式中，以大肠杆菌为出发菌株，过表达编码琥珀酰辅酶A合成酶α亚基的基因sucD，富马酸还原酶的基因frdABCD。

在一种实施方式中，所述工程菌株还过表达了编码丙酮酸羧化酶的基因pyc。

在一种实施方式中，所述基因sucD的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述基因frdABCD的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述基因pyc的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli Mad1415。

在一种实施方式中，所述工程菌株是以pACM4G质粒为载体。