本发明属于生物工程领域，具体涉及用于高效外源蛋白表达和高密度培养的基因工程枯草芽孢杆菌。通过对组氨酸缺陷型枯草芽孢杆菌进行遗传改造，通过基因操作恢复其hisC基因的功能，以获得非营养缺陷型菌株。进一步地，通过敲除基因spoIIAC和srfAC，获得的菌株更适于用于表达多种异源蛋白。本发明获得的用于表达异源蛋白的非营养缺陷型枯草芽孢杆菌，可提供一种低成本高密度发酵技术，能够大幅降低发酵成本，并高水平表达异源蛋白。
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及用于高效外源蛋白表达和高密度培养的基因工程枯草芽孢杆菌。
背景技术
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）广泛应用于工业酶制剂的生产和代谢产物的合成，具有以下优点：第一，它具备安全的表达系统。B. subtilis是国际公认的安全微生物（GRAS），可用于食品的生产，没有大肠杆菌（Escherichia coli）等革兰氏阴性细菌产生的内毒素，也不会产生引起人类和哺乳动物发热的热源性脂多糖（LPS）和致热致敏性蛋白质。第二，繁殖迅速，培养周期短，发酵技术相对成熟。第三，B. Subtilis具有多种蛋白分泌途径，本身能分泌多种蛋白酶和淀粉酶，且只有单层的细胞膜，胞内蛋白不易形成包涵体。第四，遗传背景清晰，超过70种枯草芽孢杆菌完成全基因组测序，基因组学、转录组学、蛋白质组学和分子生物学等领域的研究也得到迅速发展；存在一批丰富的质粒表达系统、基因组编辑工具和基因表达调控工具。第五，密码子没有明显的偏爱性。
B. subtilis 168及其衍生体，由于其生长特性好且性质稳定，是实验室研究和工业化生产最常用的枯草芽孢杆菌宿主。由于B. subtilis168生长到稳定期后会向胞外分泌大量蛋白酶，容易造成目标蛋白的降解和产量的下降，前期科研人员对其蛋白酶基因进行了改造，获得了一系列蛋白酶缺陷菌株。例如，1984年，Kawamura等人通过对B. subtilis 168进行改造，构建了中性蛋白酶基因（nprE）和碱性蛋白酶基因（aprE）的失活菌株B. subtilis DB104，胞外蛋白酶酶活B. subtilis 168减少96%以上（ Kawamura F , Doi R H. Construction of a Bacillus subtilis double mutant deficient inextracellular alkaline and neutral proteases.[J]. Journal of Bacteriology,1984, 160(1):442-4.）。1989年，Wang等人在B. subtilis DB104菌株基础上敲除失活丝氨酸蛋白酶基因（epr），胞外蛋白酶酶活降至B. subtilis 168的1%以下。随后，还有研究构建了缺失了六个胞外蛋白酶的菌株B. subtilis WB600、七个胞外蛋白酶基因的菌株B. subtilis WB700和缺失了八个胞外蛋白酶的菌株B. subtilis WB800，使胞外蛋白酶水解能力降低至B. subtilis 168的0.32%以下（Wu X C , Lee W , Tran L , et al.Engineering a Bacillus subtilis expression-secretion system with a straindeficient in six extracellular proteases.[J]. Journal of Bacteriology, 1991,173(16):4952-4958.）。这些对蛋白酶的敲除改造有利于提高枯草芽孢杆菌对异源蛋白的表达效率。
