[发明专利]一种用于检测端粒酶的方法及其专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测端粒酶的方法及其专用试剂盒。本发明提供的检测端粒酶活性的方法(Biotin‑DTA)，依次包括如下步骤：(1)取供试生物样本，进行细胞裂解，得到细胞裂解液；(2)取细胞裂解液，通过免疫沉淀进行端粒酶的纯化，得到纯化端粒酶溶液；(3)制备反应体系，进行延伸反应；所述反应体系中含有5’端具有生物素标记的引物、dNTP、KCl和纯化端粒酶溶液；(4)收集延伸反应产物；(5)依次进行电泳、转膜、紫外交联和信号检测，以特征条带的多少和/或信号强弱来反应供试生物样本的端粒酶活性。本发明建立了一种定量准确且无需PCR且无放射性的直接检测端粒酶的方法，具有优异的稳定性、可行性及敏感性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及一种用于检测端粒酶的方法及其专用试剂盒，具体涉及一种利用生物素标记的无需PCR且无放射性的直接检测端粒酶的方法及其专用试剂盒。

背景技术

端粒(Telomere)是真核细胞染色体末端的特殊结构。人端粒是由6个碱基重复序列(TTAGGG)和结合蛋白组成。端粒有重要的生物学功能，可稳定染色体的功能，防止染色体DNA降解、末端融合，保护染色体的稳定性，调节细胞生长。由于正常细胞线性DNA复制时5'末端消失，随着体细胞不断增殖，端粒逐渐缩短。当细胞端粒缩至一定程度，细胞停止分裂，处于衰老状态。故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”(Mistosis clock)，端粒长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关。端粒酶(Telomerase)具有端粒延伸功能，是由RNA和蛋白质组成的核糖核酸-蛋白复合物，其RNA组分为模板，蛋白组分具有催化活性，在端粒5'末端合成端粒重复序列。

癌症已逐渐成为导致人类死亡的最主要原因，全球每年癌症新发病例逐渐上升，死于癌症的患者也呈上升趋势。据统计，我国癌症的新发病例和死亡病例的数量在全球中占比最高，分别为24％和30％。预计癌症将成为本世纪预期寿命增加的最大障碍。因此癌症的诊断及治疗仍然是人类急需解决的重大问题。随着医学技术的发展，癌症的诊断手段也不断增多。端粒酶为端粒的末端不断增加(TTAGGG)的重复序列，使得端粒不会因为细胞分裂缩短，从而细胞获得永生化。研究表明，90％的肿瘤细胞端粒酶高表达，而正常细胞和良性组织的细胞不表达端粒酶，因此，端粒酶可以作为肿瘤诊断的标记物来协助肿瘤的早期诊断、判断患者的预后及检测是否复发。并且，端粒酶在肿瘤的发生发展过程中起到关键作用，随着对端粒酶的不断深入研究，靶向端粒酶的相关药物在肿瘤治疗中也发挥一定作用。

近几十年来，呈现出了许多端粒酶活性检测的改进方法，都是围绕如何提高敏感性和特异性、减少检测时间、降低检测成本。

基于PCR的TRAP是目前应用最广泛的检测方法，自从它问世以来，就受到了广大实验工作者的欢迎，是目前检测端粒酶活性的主要方法之一。TRAP有极高的敏感性，通过PCR扩增产物后能放大几亿倍的强度。但是TRAP也存在一些缺点：细胞裂解液中的其它分子会对端粒酶有抑制作用，细胞内的生物分子(比如胆汁盐、血红蛋白、肝素和乳铁传递蛋白等)会抑制PCR反应中的Taq聚合酶，从而出现假阴性；PCR过程中可能会出现扩增错误、耗时较长，循环数不好控制等问题，低浓度的差异明显，高浓度的差异不明显，不能反应端粒酶的持续结合能力，对于端粒酶活性定量欠佳；使用放射性标记物可能有放射性污染，因此应用受到局限；容易出现假阳性；对于疾病的诊断带来不利影响。

近年来出现的免PCR的直接端粒酶活性检测方法(DTA)，在实验室也逐步受到重视，该方法能够准确定量，对于细胞生物及体外生物化学的端粒酶研究有一定的优势。不过该方法使用同位素标记，实验过程中，存在同位素污染，并且³²P的半衰期短，2周左右，如果订购试剂的话，到国内需要一定时间，容易衰减，影响实验的结果。每次用量大，要消耗100-200uCiα-³²P，费用大。