[发明专利]基于RCA-PCR-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于RCA‑PCR‑CRISPR‑cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒。本发明提供了核酸分子组合物，包括特异引物对、特异crRNA和特异引物组。特异引物对由序列10所示DNA分子和序列11所示DNA分子组成；特异crRNA为序列9所示的RNA分子；特异引物组由8种引物组成，依次如序列1至序列8所示。应用核酸分子组合物检测HBV cccDNA的方法：(1)提取受试者肝脏组织的总DNA，然后进行PSAD消化；(2)采用所述特异引物组进行RCA扩增；(3)采用所述特异引物对进行PCR扩增；(4)进行基于CRISPR‑Cas13a系统的可视化检测；所述CRISPR‑Cas13a系统的crRNA为所述特异crRNA。本发明具有非常重要的临床应用前景和开发价值。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种基于RCA-PCR-CRISPR-cas13a检测HBV cccDNA的试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，属嗜肝DNA病毒科。在乙型肝炎病毒的复制过程中，病毒DNA进入宿主细胞核，在DNA聚合酶的作用下，两条链的缺口均被补齐，形成超螺旋的共价、闭合、环状DNA分子(covalentlyclosed circularDNA，cccDNA)。细胞外乙型肝炎病毒DNA是一种松弛环状的双链DNA(relaxed circularDNA，rcDNA)分子。cccDNA是乙型肝炎病毒前基因组RNA复制的原始模板，虽然其含量较少，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，但对乙型肝炎病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。

全球HBV慢性感染者约为2.57亿人，由HBV感染引起的失代偿肝硬化、肝衰竭和肝癌导致约90万人死亡，我国人群整体携带率为6.1％，约占全球的1/3。慢性乙型肝炎难以治愈的关键因素是未能彻底清除的HBV cccDNA，它是病毒复制产生的所有RNA和子代病毒合成的模板，可以在肝细胞核内持续、稳定地存在，且目前现有的抗病毒药均不能清除cccDNA，故HBV cccDNA的存在被认为是HBV感染慢性化及抗HBV治疗停止后肝炎复发最主要原因，解析cccDNA的调控机制被国内外专家公认为是慢乙肝治愈策略中需要优先解决的重要科学问题。因此，HBV cccDNA的检测对深入研究HBV致病机制、评价乙肝患者药物疗效等方面具有重要意义。

HBV cccDNA在患者肝脏中的水平极低，每个肝细胞内只有约5～50个拷贝，对检测技术的灵敏度提出了较高要求。乙肝病毒双链DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)分子与ccc DNA序列的高度同源性，又需要检测技术同时具有高度特异性。

目前HBV cccDNA常用检测技术包括：①Southern印迹杂交：该方法定性检测较为准确，但操作繁琐、敏感性较低且不能准确定量，需标本量也较大，故在临床上应用较少；②套式或选择性聚合酶链式反应(PCR)：检测敏感性比较好，但是由于需要多次扩增，并且对PCR产物进行再次扩增，导致假阳性；③实时荧光定量PCR法：该检测方法的特异性比选择性PCR进一步提高，可以消除高rcDNA背景可能产生的非特异性扩增，灵敏度也明显提高，但仍不能完全排除rcDNA非特异性扩增存在；④微滴式数字PCR(ddPCR)方法：ddPCR方法能够检测到血清、单细胞和FFPE肿瘤组织中的cccDNA，与Southern blot及其他方法相比，检测cccDNA的灵敏性提高，但是价格昂贵，不利于广泛推广。

滚环扩增(rolling circle amplification，RCA)是借鉴自然界中环状病原微生物DNA分子的滚环复制方式而建立的一种核酸扩增技术，是一种恒温DNA扩增技术，以环形DNA为模板进行复制，最后形成一条与环形互补的DNA序列，复制效率高，可用于大的环形DNA模板的扩增。