[发明专利]基于RAA-CRISPR-Cas13a技术检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒

说明书

本发明公开了基于RAA‑CRISPR‑Cas13a技术检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒。本发明提供了用于检测乙型肝炎病毒DNA的成套引物组，由RAA引物对和crRNA组成；所述RAA引物对根据SEQ ID No.1所示核苷酸序列设计；所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与Cas蛋白结合，所述向导序列与所述RAA引物对的扩增产物序列相匹配。本发明采用RAA技术与CRISPR‑Cas13a技术结合方法，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于HBV DNA检测的RAA引物序列及靶向该序列的特异性crRNA，本发明方法简便、快速、具有极高的灵敏度和特异性。灵敏度达到10拷贝/μL。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及基于RAA-CRISPR-Cas13a技术检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)感染是世界性的公共卫生问题，全球有超过2.5亿的HBV感染者，每年大约有88.7万人死于HBV感染所导致的其他疾病。我国目前的乙肝感染者大约有7000万例，有80％的肝癌和乙肝相关。所以，HBV对人类的健康产生了极大的威胁，对其早发先发现、早治疗，是降低肝硬化、肝癌等严重肝病的发病率的重要保证。HBV DNA是乙肝病毒复制的基础，也是乙肝病毒感染最直接的指标，HBV DNA越高表示病毒复制越活跃，传染性强。因此，对HBV DNA的检测尤为重要。目前检测HBV DNA的技术有实时荧光定量PCR、酶联免疫吸附法和分子杂交等，它们存在着一些不足，例如，灵敏度不高、检测时间长和假阳性率较高等，并且操作较复杂，对仪器设备的要求较高。

Cas13a是一个RNA引导的CRISPR效应蛋白，它能够特异性靶向切割单链RNA，并在切割后仍保持活性，继续切割其他非靶标RNA，这种特性被称为“附带切割”。研究人员利用Cas13a的这种附带切割活性，将其分子诊断检测中。2017年美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific High Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。

发明内容

本发明的目的是提供基于RAA-CRISPR-Cas13a技术检测乙型肝炎病毒DNA的试剂盒。

第一方面，本发明要求保护一种用于检测乙型肝炎病毒DNA的成套引物组。

本发明所要求保护的用于检测乙型肝炎病毒DNA的成套引物组，具体由RAA引物对和crRNA组成。

所述RAA引物对是根据SEQ ID No.1所示核苷酸序列设计的。

所述crRNA包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与Cas蛋白结合，所述向导序列与所述RAA引物对的扩增产物序列相匹配。

进一步地，所述RAA引物对为能够以乙型肝炎病毒DNA为模板扩增得到SEQ IDNo.1的第13-134位所示DNA片段的引物对。

进一步地，所述crRNA中，所述锚定序列为SEQ ID No.10的第1-38位，所述向导序列为SEQ ID No.10的第39-66位。

在本发明的具体实施方式中，所述RAA引物对具体为由SEQ ID No.3和SEQ IDNo.9所示的两条单链DNA组成的引物对。

在本发明的具体实施方式中，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。HBVDNA的靶点序列位于HBV DNA基因组(GenBank ID：LC535950.1)第679-706位。