[发明专利]一个兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗

说明书

本发明公开了一种兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗，所述双价弱毒疫苗含有CMVsubgt;Fny/subgt;分离物的突变型RNA2；所述CMVsubgt;Fny/subgt;分离物的突变型RNA2是在CMVsubgt;Fny/subgt;分离物的RNA2全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段马铃薯Y病毒的保守序列；所插入的马铃薯Y病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CMVsubgt;Fny/subgt;分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将本发明的双价弱毒疫苗与含有CMVsubgt;Fny/subgt;分离物RNA1和RNA3的质粒混合接种，可以预防黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的危害，为田间防治CMV和PVY引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

技术领域

本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一个兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗及其在防治黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒中的应用。

背景技术

烟草是我国重要的经济作物之一，目前，限制烟草产业发展的主要因素就是烟草病毒病，堪称烟草的“癌症”，严重影响烟草的品质和质量，因此，对烟草病毒病的防治一直是生产上迫切需要解决的问题。复合侵染是烟草病毒病的特点，一般受侵染的烟草都是同时感染多种病毒病，症状复杂，单独防治一种病害往往效果不好。因此，设计能够同时抗多种病毒的策略尤为重要。

黄瓜花叶病毒(Cucumer mosaic virus，CMV)属于雀麦花叶病毒科(Bormoviridae)黄瓜花叶病毒属(Cuucmovirus)，是目前已知的寄主范围最广的植物病毒之一，可侵染100多科1200多种植物(Mochizuki et al.,2012)。CMV是造成烟草花叶的主要病原，造成植株矮化和畸形严重，叶片出现花叶和坏死，也有黄绿相间的斑驳，严重时叶片变薄，严重影响烟草的质量与产量。马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)中的马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，PVY侵染烟草时，主要发生在省长旺期，导致烟草的叶脉坏死，褐脉，黄斑，可导致烟草产量减产20％-50％，严重地块可导致烟草绝收，严重影响烟叶的质量和产量(丛鑫等，2014；孙剑萍等，2011)。

对于植物病毒病的防治，最有效的方法是抗病品种的筛选与培育，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒突变体侵染，诱导植物自身的免疫系统而防治后期侵染的同样类型强病毒株系；是一种有效的病毒防治策略。弱毒突变体可以是天然存在的，也可以通过分子生物学手段进行人工制备。

一种弱毒突变体，只能用来防治对应的强病毒。如果想同时防治不同的病毒，就需要几种不同类型的弱毒突变体。但可以通过在一个骨架病毒中插入异源病毒片段，来达到既防治骨架病毒，又防治插入片段对应的病毒得效果，这种突变型病毒就是多价弱毒疫苗。以黄瓜花叶病毒为基础病毒载体，能够兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗目前还未见有报道。

发明内容

针对上述研究背景，本发明的目的是提供一种兼抗CMV和PVY的双价弱毒疫苗，为田间防治CMV和PVY引起的植物病毒病提供了疫苗材料和有效防治措施。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗，所述双价弱毒疫苗含有CMV_Fny分离物的突变型RNA2；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2是在CMV_Fny分离物的RNA2全长序列第2661位之后插入TAATAG以及一段马铃薯Y病毒的保守序列；所插入的马铃薯Y病毒的保守序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述CMV_Fny分离物的突变型RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二方面，提供上述兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒的双价弱毒疫苗的构建方法，包括以下步骤：