[发明专利]一种用于生产香草醛的基因片段、酿酒酵母工程菌及其构建方法

说明书

本发明公开了用于生产香草醛的基因片段，属于生物工程技术领域。本发明将香草醛合成途径中关键酶的基因经过化学合成密码子优化后，利用酿酒酵母启动子、终止子构建基因表达盒，得到基因片段。本发明经过模块化设计，将生产香草醛的基因片段成功构建到酿酒酵母基因组delta15和delta17位点，得到可以生产香草醛的酿酒酵母工程菌。本发明进一步公开从所述工程菌中提取香草醛的方法。本发明的酿酒酵母工程菌可代谢葡萄糖直接生成香草醛，香草醛的合成与酿酒酵母生长相结合，实现了天然产物香草醛的酿酒酵母人工合成，并经过简单提取即可获得香草醛。本发明工艺简单，对环境友好，可用于发酵生产香草醛。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种用于生产香草醛的基因片段、酿酒酵母工程菌及其构建方法。

背景技术

香草醛，又名香兰素(3-甲氧基-4-羟基苯甲醛)，是全球最重要香料物质之一，在自然界中存在于一些植物和水果中，由于其特殊的香味，经常被用于食品添加香味制剂。香草醛是中国规定允许使用的食用香料，可作定香剂，是配制香草型香精的主要原料。也可直接用于饼干、糕点、糖果、饮料等食品的加香。香草醛也因特殊的化学和医药性质，被应用到医疗、制药、日化用品、电镀工业等多个行业，因此香草醛全球年需求量非常大。香草醛结构如下：

目前，化学合成香草醛仍然占据大部分市场，但是，化学制剂的危害性迫使人们不断寻找新的获取方法；天然植物中提取香草醛，是一种主要的获取方法，获取的产品香味纯正、安全健康，但是加剧了人类对环境的破坏，对土地资源的浪费，也存在成本高，产量低，价格昂贵等问题。因此微生物合成法便受到人们青睐。

微生物合成法，具有反应条件温和、周期短、成本低、安全性高、与天然香草醛同源性好，产生得到的物质均属于天然产物。目前在微生物异源合成香草醛的研究中，利用最多的底盘宿主菌是大肠杆菌(E.coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)。Ni，Jun等人通过使用微生物基因模拟植物的天然途径，在大肠杆菌中开发了一条新的代谢途径，用于合成香草醛，代谢工程菌株从左旋酪氨酸产生97.2mg/L香兰素，从葡萄糖产生19.3mg/L香兰素，从木糖产生13.3mg/L香兰素，从甘油产生24.7mg/L香兰素。Hansen等人在2009年，构建了一个真正的从头生物合成途径，可以从粟酒裂殖酵母(也称为裂变酵母或非洲啤酒酵母)以及面包酵母中的葡萄糖生产香兰素。分别导入三个和四个异源基因后，生产率分别为65mg/L和45mg/L。常用的微生物异源基因表达系统分为两种，(1)将多个外源基因放在同一载体质粒上，导入微生物体内，进行诱导表达，这种方法方便快捷，简单易操作。(2)利用DNA同源重组的原理导入微生物基因组上，外源基因位于基因组上，传代稳定，不易丢失，表达效果好。

由于酿酒酵母常作为植物天然产物高效合成的优质宿主平台，因此，开发一组用于生产香草醛的基因片段，并利用该组片段构建可代谢葡萄糖直接生成香草醛的酿酒酵母工程菌，实现天然产物香草醛的酿酒酵母人工合成是本领域需要解决的技术问题之一。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一组用于生产香草醛的基因片段，可用于构建生产香草醛的酿酒酵母工程菌，实现了天然产物香草醛的酿酒酵母人工合成，并经过简单提取即可获得香草醛。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一组用于生产香草醛的基因片段，包括基因片段1～8；

所述基因片段1含有上游同源序列delta15-up，营养缺陷型标签，同源片段L1；

所述基因片段2含有同源片段L1，基因表达盒TDH3-Sam8-TPI1，基因表达盒ADH1-Sam5-GIT，同源片段L2；

所述基因片段3含有同源片段L2，基因表达盒TEF2-Comt-CYC1，同源片段L3；