[发明专利]一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用

说明书

本发明属于植物抗病毒基因工程领域，公开了一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用。制备方法包括：(1)以pHSE401为骨架，构建载体，以在StPCaP1基因的第762位至第781位核苷酸引入插入、缺失或替换突变；(2)将获得的载体转化农杆菌，将筛选出的农杆菌阳性转化子利用农杆菌介导的叶盘转化法转化马铃薯，筛选StPCaP1基因敲除的马铃薯植株；(3)摩擦接种马铃薯病毒至StPCaP1基因敲除的马铃薯植株，检测其抗病毒能力，得到抗病毒马铃薯植株。采用本发明的制备方法制备得到的抗病毒马铃薯植株，能够明显抑制马铃薯病毒，尤其是马铃薯Y病毒的侵染，显著减轻植物受马铃薯Y病毒感染后的伤害，能够显著减少损失。

技术领域

本发明属于植物抗病毒基因工程领域，具体地说，涉及一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用。

背景技术

病毒病是作物上的重要病害，给农业生产造成巨大损失。由于作物病毒病种类多，传播途径复杂，而生产上没有免疫或高抗病毒病的品种，市场上也没有对病毒病特效的药剂，因而病毒病的防治非常困难。

引发病毒病的植物病毒种类繁多，例如烟草花叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯病毒等。马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒寄主范围较广，可侵染马铃薯、烟草、番茄和辣椒在内的多种茄科作物，造成巨大的经济损失。

马铃薯是我国第四大粮食作物，其种植面积与总产量均位列全球之首。而病毒病成为制约其产量和质量的重要限制因素，植株感病后马铃薯薯块商品价值降低，严重减产甚至绝收，造成重大经济损失，不利于民生。

为了提高作物的抗病毒能力，可以对作物植株进行优化培育。而传统育种方法时间周期长、效率低；转基因技术虽然高效，但因安全性存在较大争议目前应用受到限制。例如申请号为200910191952.5的中国专利公开一种利用基因工程技术获得高抗病毒马铃薯植株的方法，将Tm-2²基因转入马铃薯，并通过筛选、鉴定而获得已表达Tm-2²基因的高抗病毒植株。该方案通过植物基因转化马铃薯，安全性存在争议，应用受到限制。

基因组编辑技术的出现，克服了以往方法的局限性，尤其是CRISPR/Cas9技术的设计简便和低成本使其在全基因组水平进行定向编辑成为可能，可以高效地实现特定位点的编辑。通过基因组编辑调节特定的植物防御机制，是目前提高植物抗病性最有效的措施之一。

目前关于马铃薯基因编辑的报道较少。倘若能够通过基因工程的改造获得能够抗病毒的马铃薯植株，则能够防治马铃薯病毒病，可以减少经济损失。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种抗病毒马铃薯植株的制备方法及其应用。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑方式获得了抗病毒的马铃薯植株，能够显著减轻植物受病毒尤其是马铃薯Y病毒属病毒侵染后的危害。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

本发明的第一目的是提供一种抗病毒马铃薯植株的制备方法，包括以下步骤：

(1)以pHSE401为骨架，构建载体，以在StPCaP1基因的第762位至第782位核苷酸引入插入、缺失或替换突变；

(2)将获得的载体转化农杆菌，将筛选出的农杆菌阳性转化子利用农杆菌介导的叶盘转化法转化马铃薯，筛选StPCaP1基因敲除的马铃薯植株；

(3)摩擦接种马铃薯病毒至StPCaP1基因敲除的马铃薯植株，检测其抗病毒能力，得到抗病毒马铃薯植株。