[发明专利]基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，属于微生物检测技术领域。所述病原微生物检测引物组包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n‑1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56。本发明还公开了包含所述引物组的病原微生物检测试剂盒，以及利用引物组或试剂盒对病原微生物检测的多重PCR扩增方法。利用本发明检测病原微生物，具有病原覆盖全面、灵敏度高、检测通量高、成本低等优势，能够辅助临床精准识别常见病原体，涵盖细菌、真菌、DNA病毒、RNA病毒、寄生虫、支原体衣原体等，具有重要的临床应用价值。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体地，涉及基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法。

背景技术

我国目前感染性疾病诊断水平亟待提升，2017年统计数据显示，我国传染性疾病发病率和死亡率分别为509.54(1/10万)和1.43(1/10万)，依然保持上升趋势。相对于全球而言，我国的感染性疾病诊疗水平偏低，HIV、TB患病率和死亡率分别为3.6(1/10万)和0.76(1/10万)，与发达国家差距较大。在我国每年感染性疾病患者中，超过3亿的患者需使用病原检测手段检查进一步辅助诊断，其中危重感染病人人数超1000万人，比如重症肺炎发病人数每年约400万，脓毒血症约560万，新发脑膜炎约85万。针对这些感染类型较为复杂的危重感染病例，目前常规检测手段的无法满足治疗需求。除此之外，新发现病原微生物，以及耐药性不断增强甚至出现多重耐药的病菌涌现，使得临床医生的经验性治疗或常规治疗时常会出现无效的现象。因此，快速明确病原体是有效控制感染的基础。如SARS、高致病性禽流感、西尼罗病毒、寨卡病毒及埃博拉病毒感染等、这类疾病的传染性极强，可能会造成世界性大流行，因此对此类病原体快速、准确地检测为新型诊断技术创造了巨大的市场。据统计，2017年全球微生物诊断行业市场规模为161.6亿美元，增速为4.75％，我国仅为14亿美元左右，增速低于2％，未来发展空间巨大。

传统的病原微生物鉴定技术主要分为两类：基于培养的方法例如形态学观察、细胞生理生化特征、细菌培养分型、基因芯片、自动化微生物分析系统等；基于特异引物/探针/抗体的方法例如抗原抗体反应、PCR反应检测以及各种特异性的病原微生物快速检测系统等。这些技术在日常病原微生物确证中发挥了重要作用，但也存在一定的不足：前者需要依赖培养、周期长、鉴定精度低；后者需要一定的微生物序列先验知识、无法实现高通量检测等。

基于宏基因组二代测序的病原微生物检测(mNGS)，是一种不依赖培养，借助二代测序平台快速测序直接从环境/临床样品中提取全部微生物的核酸序列，进一步与各个物种的基因组序列对比，从而得知样品中微生物的种类和比例的高通量测序方法，可广泛分析临床样本微生物组(细菌、真菌、病毒)。相比传统培养方法，mNGS拥有更高敏感性以及更快的检测速度，但是在实际应用中，还有一些难以解决的问题，这也限制其广泛应用：

1.无法准确区分检出微生物是定植菌、背景菌、致病菌；

2.mNGS技术对于胞内菌、真菌两类微生物检测敏感性较低：由于测序成本的限制，mNGS需尽量排除人源细胞的干扰。因此针对胞内感染菌如结核分枝杆菌、军团菌等，由于其在体液内密度较低而导至检测敏感性偏低；同时mNGS对于具有较厚细胞壁的病原体及真菌核酸提取效率较低，导至检出率和敏感性较低。

3.对RNA病毒检测难度大：RNA转录本身有更高的丰度和复杂度，又容易降解，对运输和保存的要求较高，因此RNA病毒的临床检测还存在一定的困难。

4.标准难以统一：从测序结果的可靠程度来讲，不同的测序公司，对于可靠程度的数据采用不同的报告方法，如深度、覆盖度、丰度、估测浓度、置信度，各有千秋，尚无统一标准。

5.高宿主背景：一般样本类型如血液、肺泡灌洗液、痰液、胸腹水等，宿主基因组污染比例一般在80％以上，这就导致测到的微生物序列非常少，很大一部分数据都无法有效利用。