[发明专利]基于靶向测序的病原微生物检测引物组、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种基于靶向测序的病原微生物检测引物组，其特征在于，包括第1引物对至第56引物对，其中，第n引物对由SEQ ID No.(2n-1)所示的第n正向扩增引物和SEQ ID No.2n所示的第n反向扩增引物组成，n＝1～56。

2.根据权利要求1所述的病原微生物检测引物组，其特征在于，每条正向扩增引物的5'端连接有SEQ ID No.113所示的正向通用引物，每条反向扩增引物的5'端连接有SEQ IDNo.114所示的反向通用引物。

3.根据权利要求2所述的病原微生物检测引物组，其特征在于，还包括接头引物对，包括SEQ ID No.116所示的正向接头引物和SEQ ID No.117-123任一所示的反向接头引物。

4.一种基于靶向测序的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-3任一所述的病原微生物检测引物组。

5.根据权利要求4所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR缓冲液和DNA聚合酶。

6.根据权利要求5所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样本总DNA提取试剂、PCR扩增产物纯化试剂。

7.根据权利要求4-6任一所述的病原微生物检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对照DNA，所述对照DNA的核苷酸序列如SEQ ID No.115所示。

8.一种非诊断和治疗目的基于靶向测序的病原微生物检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，获得待测样本的总DNA；

S2，以步骤S1获得的总DNA为模板，利用权利要求2所述的引物组进行多重PCR扩增；

S3，以步骤S2获得的多重PCR扩增产物以及对照DNA作为模板，利用权利要求3所述的接头引物对进行PCR扩增，对多重PCR扩增产物添加测序接头序列，得到测序文库；

S4，对步骤S3获得的测序文库进行高通量测序，得到测序序列；

S5，将测序序列与病原微生物靶标序列数据库进行比对，统计准确比对上特定病原微生物靶标的reads数；

S6，利用下述公式计算病原微生物近似浓度C：

C＝N×P/2M×10²/mL

其中，N为对照DNA浓度，M为对照DNA reads数，P为准确比对上特定病原微生物靶标的reads数。

9.根据权利要求8所述的病原微生物检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述多重PCR扩增的体系为：25μL体系中，所述引物组2μL，总DNA模板7.5μL，2×MuLtiplex PCR Buffer12.5μL，MuLtiplex DNA Polymerase 1μL，对照DNA 2μL。

10.根据权利要求9所述的病原微生物检测方法，其特征在于，步骤S2中，所述多重PCR扩增的程序为：94℃预变性5min，循环1次；98℃变性15sec，60℃退火5min，68℃延伸40sec，循环8次；68℃后延伸10min，循环1次；4℃保存。