[发明专利]一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒及制备方法

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒，其特征在于：包括引物对以及探针，所述的引物对为：上游引物IS1081-F₁与下游引物IS1081-R₁，两者序列如SEQ ID NO.1~2所示；所述的探针为探针IS1081-P₁，其序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒，其特征在于：所述的引物对为根据Pub-Med基因库已知的结核分枝杆菌复合群特定靶基因IS1081基因的核苷酸序列进行设计得到的。

3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒，其特征在于：所述的结核分支杆菌复合群包括标准结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、山羊分枝杆菌中的一种或多种。

4.根据权利要求1~3任一项所述的一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1根据Pub-Med基因库中所提供的结核分枝杆菌复合群基因序列，以H37Rv结核分枝杆菌全基因组进行多序列比对，选取保守区域，针对结核分枝杆菌复合群特定靶基因IS1081设计出如SEQ ID NO.1~21所示的上游引物IS1081-F与下游引物IS1081-R以及探针IS1081-P；

S2利用所述的引物和探针，选取qPCR MIX反应体系，形成混合体系；

S3针对混合体系，加入标准样品，同时选取PCR扩增体系，混合均匀后置于荧光定量PCR仪器进行PCR扩增，得到扩增结果；

S4针对得到的扩增结果，分别进行灵敏性和特异性测试，判定设计出的探针的灵敏性与特异性针；

S4对灵敏性和特异性测试的结果，以标准基因为参照，判定设计的探针位点是否合理，若合理，执行下一步骤，若不合理，返回S1中重新设计；

S5筛选得到上游引物IS1081-F₁与下游引物IS1081-R₁的引物对以及探针IS1081-P₁，即为所述的制备方法。

5.根据权利要求4所述的一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的灵敏性测试为，对结核分枝杆菌H37Rv全基因组DNA菌株进行10倍梯度稀释，分别为10⁰-10⁶倍，每个浓度取2μL至所述的混合体系中，以超纯水作为阴性对照，进行试剂盒的灵敏性试验。

6.根据权利要求4所述的一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的特异性测试为，以结核分枝杆菌H37Rv全基因组DNA的结核分枝杆菌作为阳性对照，使用牛结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、山羊分枝杆菌、大肠杆菌、鲍曼杆菌、肺炎克雷伯氏菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的DNA作为特异性检测的样本，超纯水作为阴性对照，分别对上游引物IS1081-F与下游引物IS1081-R组成的引物对以及探针IS1081-P进行PCR扩增，判定其对各种菌群的特异性。

7.根据权利要求6所述的一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的牛结核杆菌选用BAA-935D-2标准DNA的牛结核分枝杆菌、所述的非洲分枝杆菌选取25420DQ标准DNA的非洲分枝杆菌、所述的田鼠分枝杆菌选取19422DQ标准DNA的田鼠分枝杆菌、所述的山羊分枝杆菌选取BAA-824D-2标准DNA的山羊分枝杆菌。

8.根据权利要求7所述一种结核分枝杆菌复合群快速检测诊断试剂盒的制备方法的，其特征在于：所述的qPCR扩增的体系及程序由Vazyme qPCR预混液试剂盒提供，所述的扩增体系具体为：10μL的qPCR MIX、0.4μL的10μmol/L的所述的引物对、0.2μL的10μmol/L的探针IS1081-P、2μL的DNA模板、7μL的ddH₂O；

所述的扩增程序具体为：37℃污染消化2 min，95℃预变性5 min，95℃变性10 s，60℃退火30s，变性和退火进行45个循环。