[发明专利]一种蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法

说明书

本发明建立了一种蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法。该方法在自组装功能核酸水凝胶的基础上，引入靶标响应单元，通过包埋物的可控释放实现了靶标的可视化检测。本发明通过软刷子水凝胶与DNA超级三明治结构间的自组装增加了DNA双链区域，提高了水凝胶网络的刚性，同时为包埋物提供了嵌合位点；微观形态上呈纳米花相互交联形成的蜘蛛网状结构，且交联密度与纳米花的粒径大小可通过探针与DNA超级三明治结构的浓度以及施加的离心力进行调节。本发明所构建的蜘蛛网状功能核酸水凝胶制备方法具有速度快，形貌可控，靶标响应，包埋物可控释放且通用性强等优点，在包括分子检测、药物装载与递送等方面，具有非常好的应用前景。

技术领域

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种蜘蛛网状自组装功能核酸水凝胶的制备方法。

背景技术

传统的核酸水凝胶制备方法多依赖于通过人工合成高浓度寡核苷酸链经互补配对形成基础单元结构再进一步自组装搭建成交联的水凝胶网络。该方法操作繁琐，核酸消耗量大，依赖于精密仪器，合成成本较高。获得的核酸水凝胶一方面微观形貌单一，并且在制备过程中难以调控其大小及形貌结构；另一方面，由于基础单元结构简单，因此通过传统方法制备核酸水凝胶在功能设计上难以创新，从而导致其应用受限。滚环扩增（RCA）技术由于可产生长核酸链并在反应过程中形成具有微观纳米花结构水凝胶状产物而成为了一种经济、有效的核酸水凝胶制备策略，克服了传统方法中核酸消耗量大，人工合成DNA链长度受限的问题。然而，目前基于RCA技术制备核酸水凝胶在机械强度提升、功能性增强以及微观形貌可控等方面的研究仍十分有限。

发明内容

本发明建立的核酸水凝胶制备的新方法，克服了现有水凝胶制备方法的不足，实现了快速、简单高效、形貌可控、靶标响应、包埋物可控释放的核酸水凝胶的制备。

本发明的一个目的是提供一种制备方法，所述方法基于一种体外恒温核酸扩增技术，所述体外恒温核酸扩增技术的反应体系包括锁式探针和连接引物，其特征在于，所述锁式探针的5’端经过磷酸化修饰且含有与连接引物互补的区域；所述连接引物能够与锁式探针的5’端和3’端杂交形成2段相邻的碱基互补配对区域；

所述互补包括现有技术或公知常识所定义的互补或反向互补，和/或根据现有技术或公知常识所定义的互补原则进行互补或反向互补。

所述聚合酶包括可用于体外核酸扩增技术的聚合酶。

所述连接酶包括可用于体外核酸扩增技术的连接酶。

所述扩增反应体系中的序列包括现有技术或公知常识所定义的序列，公众可直接人工合成获得，其制备方法属于现有技术；所述设计包括现有技术或公知常识所记载的设计方法。

所述方法还包括下述1）-3）中的至少一种：

1）所述体外核酸扩增技术包括滚环扩增反应，所述滚环扩增反应的反应过程包括：连接反应和扩增反应两部分；

2）所述连接反应包括将锁式探针与引物进行杂交的过程，反应过程包括：80～100℃，5～10min，缓慢降温；将杂交产物在连接酶的作用下，使锁式探针生成环化模板的过程，反应过程包括：16～30℃，20min～3h；

3）所述扩增反应包括环化模板与引物进行扩增的过程，反应过程包括：30～37℃，10h～30h。

4）所述锁式探针包括具长链结构且5’端经过磷酸化修饰的化合物。

再具体的，5’端磷酸化修饰的化学结构为：

具体的，所述方法还包括下述1）-6）中的至少一种：

1）所述锁式探针包括：将序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列5’端经过磷酸化修饰得到的引物；

2）所述连接引物包括序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；