[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用

说明书

本发明公开一种基于CRISPR‑Cas12a系统的可视化病毒检测方法，所述方法通过将病毒基因组反转录或者直接进行PCR扩增获得dsDNA，即target DNA。设计特异靶向病毒基因的crRNA。当target DNA存在时，Cas12a‑crRNA特异识别目标DNA并激活Cas12a非特异ssDNase活性，降解连接AuNPs‑DNA探针的linker ssDNA，诱导AuNPs‑DNA聚集‑分散状态的改变，纳米金聚集‑分散状态的改变产生明显的颜色变化。该颜色变化可通过肉眼直接判断，也可通过智能手机App颜色识别器读取和分析检测结果。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其是一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用。

背景技术

病毒感染严重危害人类健康，病毒检测对于疾病的诊断、预防和治疗至关重要，开发有效、准确、快速以及灵敏的检测工具对于疾病控制有着至关重要的作用。尽管在实验室方面检测方法的开发已经取得了巨大的进步，但是仍然需要加强对于非实验室条件下的检测方法开发，尤其要推动现场检测方面(point-of-care testing,POCT)需要建立广泛的适用性。基于CRISPR-Cas的核酸检测技术为开发灵敏快速POCT检测提供了新颖的方式。目前，病毒的检测方法主要包含核酸检测、抗体检测、抗原检测。但是由于抗原检测检出率较低，目前新冠检测主要集中在抗体和核酸检测。其中核酸检测具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，被认为是检测病毒感染的“金标准”；尽管核酸扩增测试(PCR/RT-PCR)是目前较早检测病原体的最敏感、最特异的方法，但是由于需要专门的实验室设备和训练有素的技术人员，不适合用于快速的及时诊断。此外，高传染性的病原体则需要实时监测，以便阻止它们在人与人之间的传播。而抗体检测操作便捷、检测迅速，可作为核酸诊断的补充手段，但由于抗体检测“假阳性”和“假阴性”的局限性，不适合用于复工复产复学等普通人群筛查，也不适用于在低流行地区的流行病学调查背景技术。

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced palindromic repeat)系统是存在于大部分细菌和古细菌中的获得性免疫系统。成簇规律间隔短回文重复(CRISPR)以及CRISPR相关(Cas)基因编码构成的RNA介导的免疫系统可以保护细菌和古菌免受病毒和外来DNA的入侵。近年，一些CRISPR-cas系统，包括Cas13a和Cas12a发现在crRNA(CRISPR RNA)识别靶标序列时具有非特异性的核酸切割活性(也称为反式切割)。这种反式切割活性为高灵敏度、高选择性的核酸检测提供了依据。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法，所述方法通过将病毒基因组RNA逆转录得到cDNA，DNA基因组不需要逆转录过程，再通过PCR扩增获得dsDNA，得到的产物称其为Target DNA，即目标DNA，设计特异靶向病毒基因序列的crRNA，利用Cas12a-crRNA复合物检测target DNA。

而且，所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2。

而且，具体步骤如下：

当Cas12a-crRNA检测到相应的Target DNA时，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM远离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加来检测新型冠状病毒SARS-CoV-2；此外，利用纳米金聚集颜色改变性质，纳米金颜色的深浅与Target RNA浓度，即新型冠状病毒基因组RNA的浓度具有线性关系，通过智能手机颜色识别器APP从而能够将新冠病毒基因组RNA的浓度即新型冠状病毒拷贝数转化成具体的数值输出。