[发明专利]一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法及应用

权利要求书

1.一种基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法，其特征在于：所述方法通过将病毒基因组RNA逆转录得到cDNA，DNA基因组不需要逆转录过程，再通过PCR扩增获得dsDNA，得到的产物称其为Target DNA，即目标DNA，设计特异靶向病毒基因序列的crRNA，利用Cas12a-crRNA复合物检测target DNA。

2.根据权利要求1所述的基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法，其特征在于：所述病毒为新型冠状病毒SARS-CoV-2。

3.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法，其特征在于：具体步骤如下：

当Cas12a-crRNA检测到相应的Target DNA时，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM远离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加来检测新型冠状病毒SARS-CoV-2；此外，利用纳米金聚集颜色改变性质，纳米金颜色的深浅与Target RNA浓度，即新型冠状病毒基因组RNA的浓度具有线性关系，通过智能手机颜色识别器APP从而能够将新冠病毒基因组RNA的浓度即新型冠状病毒拷贝数转化成具体的数值输出。

4.根据权利要求3所述的基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法，其特征在于：具体步骤如下：

target DNA存在时能够激发Cas12a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链DNA；在此情况下，若合成一条，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporter DNA，即报告DNA，reporter DNA就能被Cas12a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测新型冠状病毒的浓度能够成线性关系，能够检测和定量新型冠状病毒；而纳米金显色实验中，linker-ssDNA序列的两端设计为可与纳米金颗粒交联的DNA序列即DNA1/2-AuNPs互补配对；后续将Cas12a/crRNA系统与DNA1/2-AuNPs等体积混合，当linker-ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2-AuNPs保持分散状态从而呈现红色；其颜色的深浅可通过智能手机颜色识别器App灰度分析读取数值；灰度分析得到的数值和待检测新型冠状病毒的浓度能够成线性关系，能够检测和定量新型冠状病毒。

5.根据权利要求2所述的基于CRISPR-Cas12a系统的可视化病毒检测方法，其特征在于：具体步骤如下：

通过两步法来检测新型冠状病毒的RNA来得到target DNA，当Cas12a-crRNA检测到相应的target DNA时，即target DNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与新型冠状病毒浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定新型冠状病毒；此外，当linker-ssDNA被Cas12a降解时，DNA1/2-AuNPs保持分散状态从而呈现红色；其颜色的深浅可通过智能手机APP颜色识别器灰度分析读取数值或者通过Tecan200 Pro plate reader测其OD值，测出的数值与新型冠状病毒浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定新型冠状病毒。