[发明专利]一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生细菌的方法

说明书

本发明公开了一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生细菌的方法，针对目前褐飞虱共生细菌定量检测方法存在的不足。本发明利用含有大肠杆菌(Escherichia coli)16S rDNA V3‑V4区和褐飞虱肌动蛋白β‑actin序列的质粒分别构建标准曲线,建立了通用的荧光定量PCR反应检测体系,本发明可以检测单位虫体的褐飞虱肠道或脂肪体内共生细菌总的数量。

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生细菌的方法。

背景技术

褐飞虱(Nilaparvata lugens)属半翅目飞虱科(Homoptera:Delphacidae)，是一种只以水稻或野生稻为食的迁飞性害虫，是亚洲稻区的重要害虫。褐飞虱肠道存在大量共生细菌，这些共生菌与褐飞虱相互依存相互影响，褐飞虱为共生菌提供了适宜的生存环境，共生菌对褐飞虱的生长、发育、营养代谢、抗性变异以及免疫功能等具有重要的作用，缺失共生菌会直接导致褐飞虱生长、发育延缓，繁殖能力丧失，以及过早死亡。

基于褐飞虱和共生菌间的紧密关系，越来越多的研究聚焦于不同处理后共生菌在褐飞虱体内的变化，旨在进一步阐明共生菌对宿主褐飞虱的影响，如取食抗性和感性水稻品种后褐飞虱肠道内共生菌的多样性差异分析，杀菌剂处理后褐飞虱肠道和肠道内共生菌数量变化等研究。目前共生菌多样性分析主要采用高通量测序分析方法，共生真菌主要以18S rDNA、ITS序列，共生细菌则以16S rDNA作为扩增子进行多样性分析，但是检测的结果只能体现某类或某种共生菌在宿主体内的相对丰度变化，并不能比较处理前后该类菌或该种菌绝对量的变化。针对个体较小的共生细菌，相关的数量测定未见报道。

为了探明不同条件处理下褐飞虱体内共生细菌的数量变化，急需建立通用的共生菌的数量测定方法。本发明以褐飞虱体内共生细菌ITS序列拷贝数与虫体β-actin基因拷贝数作比，排除褐飞虱总RNA提取过程中产生的误差，更加精准检测褐飞虱肠道和脂肪体内真实的共生细菌数量。

发明内容

本发明利用荧光定量PCR法建立了一种褐飞虱肠道/脂肪体内共生细菌快速检测方法，并可用于不同处理条件下的共生细菌数量测定。

本发明的目的是提供该快速检测方法在不同处理条件下褐飞虱肠道/脂肪体内共生细菌数量测定的应用，为后续研究褐飞虱和共生菌间的关系奠定基础。

本发明提供了一种快速检测褐飞虱肠道/脂肪体内共生细菌的方法，其包括如下步骤：

1)提取褐飞虱肠道DNA或脂肪体DNA；

2)以引物338F-806R通过菌落PCR扩增大肠杆菌(Escherichia coli)16S rDNAV3-V4序列；利用步骤1)所得DNA，以ActinF-ActinR为引物扩增褐飞虱β-Actin序列，PCR产物纯化后连接到载体pMD19-T上，然后转化到JM109感受态细胞中；

其中，引物序列如下：

338F：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；

806R：5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’；

ActinF：5’-GATGAGGCGCAGTCAAAGAG-3’；

ActinR：5’-GTCATCTTCTCACGGTTGGC-3’；

转化完成后，分别以引物338F-806R和ActinF-ActinR进行菌落PCR确认产物片段和插入片段一致；确认一致后挑取阳性克隆于液体LB培养基中培养，所得菌液提取质粒DNA，用于测序以及制备标准品；

3)根据质粒浓度与质粒bp数计算质粒拷贝数，将选定浓度梯度的质粒进行实时荧光PCR扩增，然后根据拷贝数和Ct值制作大肠杆菌16S标准曲线和褐飞虱β-actin质粒标准曲线；