[发明专利]一种外周血造血干细胞采集物来源的嵌合抗原受体T细胞的制备及应用

说明书

本发明涉及一种外周血造血干细胞采集物来源的嵌合抗原受体T细胞的制备及应用，其具体公开了一种嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其包括以下步骤：1）获得以粒细胞集落刺激因子刺激后采集得到的外周血造血干细胞采集物；2）由所述外周血造血干细胞采集物中分离，并以磁珠筛选方法获得T淋巴细胞；3）激活T淋巴细胞，并以包含嵌合抗原受体的慢病毒载体或慢病毒转导或感染激活的T淋巴细胞，得到嵌合抗原受体T细胞。本发明采用外周血造血干细胞采集物作为T细胞采集来源，用量少，仅需要1 mL外周血造血干细胞采集物即可制备嵌合抗原受体T细胞（CAR‑T细胞）的需求。

技术领域

本发明属于细胞生物学领域，具体涉及一种G-CSF动员后外周血造血干细胞来源的嵌合抗原受体T细胞的制备及应用。

背景技术

嵌合抗原受体修饰的T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells，CART)，是一种基因工程手段修饰后的T细胞。嵌合抗原受体由特异性靶向肿瘤细胞抗原胞外单链可变片段(single chain fragment variable，scFv)、铰链区、跨膜结构域和胞内信号结构域组成。近些年，CART治疗取得了巨大的成功，为治愈肿瘤提供了免疫治疗方面全新的选择。近年来，CAR-T免疫疗法除了被用来治疗急性白血病和非霍奇金淋巴瘤之外，也被用来治疗实体瘤，具有广阔的应用空间。CAR-T细胞治疗作为一种新型的细胞治疗手段，其生产过程繁琐。主要涉及：病毒质粒改造及生产、慢病毒包装及浓缩、患者外周血T细胞获取、T细胞感染及扩增等几个方面。每个过程产生问题都会严重影响下游的生产，所以每一步都必须严格质量控制。

现有技术CAR-T细胞中的T细胞来源于不同患者个体的外周血，其T细胞的异质化程度高、导致工艺性能稳健性较差，较难设定统一的标准限度。此外，有些患者的T细胞数量极低，很难分离达到培养所需的数量细胞，不利于细胞生产的规模化和质量控制，无法解决产业化的需求。且患者来源T细胞可能存在免疫功能缺陷，在体外存在培养失败的风险，在体内存在免疫逃逸的现象，存在较大工艺失败的可能(10％左右)。且为了达到培养T细胞的数量要求，需要大量的患者外周血，给实际应用带来困难。

造血干细胞(hematopoietic stem cells)是一类异质性的、具有自我更新和多向血细胞分化潜能的成体干细胞。根据来源不同，其可分类为骨髓造血干细胞、脐血造血干细胞、胎肝造血干细胞和外周血造血干细胞。外周血造血干细胞是存在于外周血中的一类具有高度更新能力和多向分化潜能的最原始的起源细胞，正常生理条件下外周血造血干细胞的含量远远低于骨髓造血干细胞的含量，约占骨髓中的0.1％-1％，CD34+细胞仅占外周血单个核细胞(PBMC)的0.01％-0.1％，但是给予动员剂后，外周血中造血干细胞含量增加。目前普遍认为，外周血造血干细胞除了具有促进造血恢复和调节免疫外，还具有抗肿瘤作用。供者经粒细胞集落刺激因子动员后采集的外周血造血干细胞采集物(G-PBSC)中的CD34+的造血干细胞在异基因造血干细胞移植和过继性细胞免疫治疗中具有相当重要的地位，G-PBSC除包含少量的造血干细胞，还包含对占主要成分的淋巴细胞和其他免疫细胞，目前针对G-PBSC来源中占有主要成分的淋巴细胞和其他免疫细胞研究较少，因为通常认为由于这一部分细胞分化程度较高，在异体中使用会导致较强的免疫作用，无法应用于异体或起到治疗作用。

通过表面标志表达的不同，T细胞可分为几个主要亚群。这些细胞被命名为初始细胞(naive T cell，TN)、干细胞样记忆T细胞(stem cell memory T cell，TSCM)、中央记忆T细胞(TCM)、效应记忆T细胞(TEM)和、终末分化效应记忆T细胞(TEMRA)和过渡记忆T细胞(TTM)。虽然效应T细胞具有强大的溶解肿瘤的能力，但是其分化程度较高，持续性较弱。只有中央心记忆T细胞和其他低分化的T细胞子集，例如初始幼稚T细胞(naive T cell，TN)和干细胞样记忆T细胞(stem cell memory T cell，TSCM)，可以在体内达到长时间的扩增以及较大的增殖能力。