[发明专利]人POLE基因突变的新型测定方法及试剂

说明书

本发明提供了一种人POLE基因突变的新型测定方法及试剂。本发明揭示了一组适用于进行POLE基因多位点突变检测的方法和试剂，可以一次性同时检测POLE基因多达11种突变型，亦可实现对每一种突变类型进行区分，不仅检测特异性和灵敏度俱佳，且操作便捷、耗时短、成本低。

技术领域

本发明属于诊断学领域，更具体地，本发明涉及人POLE基因突变的新型测定方法及试剂。

背景技术

根据目前中国癌症患者人数统计，每天超过1万人被确诊为癌症，每分钟就有7.5人被确诊为癌症，且数据还有持续上升的趋势。恶性肿瘤发病率每年保持在约3.9％的增幅，死亡率每年保持在2.5％的增幅。随着肿瘤细胞分子生物学的发展，癌症免疫治疗己开始进入临床应用，选择合适的患者进行免疫治疗是其成功的关键。

DNA聚合酶ε是具有校正功能的DNA聚合酶，其催化亚基由POLE基因编码。此酶中的核酸外切酶区(exonuclease domain of POLE，POLE-exo)，具有3’→5’核酸外切酶活性，能够及时识别并切除复制过程中产生的错误碱基。编码POLE核酸外切酶区的基因突变将导致校正功能缺失，导致突变的基因在细胞中大量累积。近年来在子宫内膜样癌、结肠癌等多种肿瘤中检测出POLE突变，表现出独特的分子表型，预后较好。故检测POLE基因核酸外切酶区是否存在突变可以判断肿瘤预后的有用指标。

POLE体细胞突变常发生在约1～2％的结直肠癌(CRC)中和7～12％的子宫内膜癌(EC)中，并且在脑，胰腺，卵巢，乳房，胃的超突变肿瘤以及子宫癌肉瘤中被检测到，最常见的突变类型是P286R、V411L、S297F、A456P、S459F，此外F367S、L424V、L424I、P346R、M444K也较为常见。这些突变直接或间接的影响了DNA聚合酶ε核酸外切酶区域的校正功能。

POLE基因突变的肿瘤细胞由于积累了大量的基因变异，导致产生的蛋白更容易被患者的免疫系统发现，故可增强患者的免疫应答。研究人员在肿瘤免疫组化染色中发现POLE突变的肿瘤中存在大量的CD8+阳性的浸润淋巴细胞和细胞毒性T淋巴细胞标志物，PD-190％，并在肿瘤微环境中鉴定出PD-L1的大量表达，表明具有POLE突变的肿瘤可能是靶向PD1-PDL1抗体药物的候选者。己有临床研究报道携带POLE基因突变的癌症患者接受针对PD-1的免疫治疗具有良好的疗效。

此外，鉴于POLE基因突变位点的多样性，一些实验室和研究机构中，POLE基因的变异研究也是被聚焦研究的对象，从而为临床试剂的开发优化奠定基础。

目前针对POLE基因突变检测方法包括高通量测序NGS、数字PCR(dPCR)。NGS方法检测步骤繁杂、试剂费用昂贵、结果判读依赖于生物信息学分析计算，检测周期长：数字PCR方法检测灵敏度可达0.1％，但其检测步骤较多、试剂费用较实时荧光PCR昂贵很多、结果判读也依赖于专用软件、对阴性/阳性区间的划分主要依赖于针对图形的主观判断。NGS和数字PCR仪器试剂昂贵，同时对操作人员也有很高要求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人POLE基因突变的新型测定方法及试剂。

在本发明的第一方面，提供一种检测POLE基因多位点突变的试剂盒，所述突变包括POLE基因第857、890、1100、1231、1270、1307、1331、1366、1376位突变；该试剂盒中包括：(1)扩增POLE基因的所述突变位点区域的特异性前引物和后引物，所述的特异性前引物和后引物扩增包含基因突变位点在内的扩增产物的长度为50～200bp(较佳地为50～150bp；例如73bp，81bp，102bp，119bp)；所述特异性前引物或后引物与突变型基因位点及邻近序列互补，较佳地前引物或后引物3’末端碱基与相应突变位点碱基互补；(2)特异性针对扩增产物的探针，所述的探针携带可检测标记；(3)Block引物，其靶向结合POLE基因突变位点对应的野生型位点，所述POLE基因突变位点为857、890、1100、1231、1366、1376。