[发明专利]一种生物催化合成多种黄酮苷的方法

说明书

本发明公开了一种生物催化合成多种黄酮苷的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过蛋白质工程改造糖基转移酶以获得更高产率与区域选择性的突变体，所得的突变体VFAH作为生物催化剂，以槲皮素，山奈酚，木犀草素或异鼠李素作为受体底物，UDP‑葡萄糖作为供体底物，催化合成多种黄酮苷。其中以槲皮素作为受体底物时，产率相比野生型提高约90倍，区域选择性也大于98％，对于底物山奈酚，木犀草素或异鼠李素，在保持高的区域选择性和转化率的同时，主要糖基化产物发生改变，因此本发明提供的突变体在黄酮苷的合成方面具有应用价值。

技术领域

本发明涉及一种生物催化合成多种黄酮苷的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

黄酮苷，作为一种生物活性物质，广泛存在于植物中，是黄酮类化合物多样性的重要来源之一。黄酮苷是通过一种称为糖基化的方法生产的，该方法被认为是植物次生代谢产物的关键修饰。糖基化对黄酮类化合物的化学性质产生多种影响，通常会改变植物体内的代谢、生物活性、吸收及生物利用度。黄酮苷的生物活性广泛，包括抗氧化、免疫调节、降血糖和抗肿瘤等活性。目前黄酮苷的来源有三种途径，一是从植物中提取分离，但是许多具有良好活性的黄酮苷在植物中的含量较低；二是化学合成方法，化学合成法又分为全合成和半合成，但通常黄酮苷产率低，选择性差，需要官能团的多步保护和去保护作用，因此难以实现多种黄酮类化合物的合成应用；三是酶催化生物合成方法，酶催化生物合成法因操作简单、条件温和、副产物少、收率高和高效绿色环保等特点而广受关注。目前酶催化生物合成黄酮苷最常用的酶有两种：糖基转移酶和糖苷合成酶。黄酮苷通常是通过植物和微生物中的糖基转移酶将活性糖供体上的糖分子转移到黄酮类受体来催化合成的，并且黄酮类化合物的骨架上的任一羟基都可糖基化，不同位置上的糖基化对其生物活性及对人体健康的潜在益处具有重大影响。

采用糖基转移酶可直接利用活性供体上的糖分子催化合成黄酮苷。由于许多糖基转移酶区域选择性专一和底物特异性，使用单一的糖基转移酶很难实现底物的不同位点的糖基化，这在一定程度上限制了结构多样的黄酮苷的合成。

发明内容

本发明旨在通过蛋白质工程手段改造印度芒果(Mangifera indica)来源的糖基转移酶MiCGT，提高产能和区域选择性。本发明还提供了一种利用糖基转移酶突变体VFAH(W93V-V124F-F191A-R282H)进行的生物催化合成多种黄酮苷的方法。该方法具有条件温和，环境友好，高的区域选择性等优点。

本发明的第一个目的是提供一种糖基转移酶MiCGT突变体VFAH，并编码如下(a)或(b)的氨基酸：

(a)其序列如SEQ ID NO:1所示的氨基酸，

(b)含有第93位缬氨酸(Val)，第124位苯丙氨酸(Phe)，第191位丙氨酸(Ala)，第282位组氨酸(His)，并且与(a)有50％同源性以上的糖基转移酶MiCGT的突变体。

本发明的第二个目的是提供编码上述糖基转移酶MiCGT突变体的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达上述的糖基转移酶MiCGT突变体VFAH。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主、pET系列的质粒为载体构建得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建，具体包括如下步骤：以pET28a为载体，将SEQ ID NO:2所示基因与载体连接，在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中重组表达SEQ ID NO:1所示的糖基转移酶。