[发明专利]一种MicroRNA捕获磁珠、制备方法及MicroRNA的检测方法

说明书

本发明提供一种MicroRNA捕获磁珠、制备方法及MicroRNA的检测方法，属于生物技术领域。该方法将链霉亲和素生物磁珠和生物素修饰的与待测hsa‑miRNA‑146b‑5p完全互补的ssDNA探针混合，得到MicroRNA捕获磁珠；将荧光基团FAM修饰的与ssDNA探针部分互补的荧光DNA和MicroRNA捕获磁珠混合杂交，制备得到荧光MicroRNA捕获磁珠；将含有hsa‑miRNA‑146b‑5p的待测液与荧光MicroRNA捕获磁珠混合，进行链置换反应，得到置换后的MicroRNA捕获磁珠。该方法操作简便，成本低。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种MicroRNA捕获磁珠、制备方法及MicroRNA的检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类短链非编码核糖核酸(RNA)分子，长度为19～25个核苷酸。miRNA参与人体内多种生物过程，如细胞增殖、分化、代谢、胚胎发生、炎症、衰老和程序性细胞死亡等。由于miRNAs具有序列短，含量低，各成员之间的序列相似度高等特点，使其检测和分析具有一定的难度。现有的miRNA检测技术主要包括Northern印迹，微阵列法，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，等温指数扩增(EXPAR)，滚环扩增(RCA)，环介导的等温扩增(LAMP)，酶辅助miRNA定量检测法等。但这些方法大多数都存在探针/引物/模板序列设计复杂，检测步骤繁琐检测时程长，需要特殊的酶或引物，费用昂贵等问题，很难大规模推广使用。近年来，核酸探针作为基因探针的一种，具有很强的亲和力和选择性，被广泛应用于生化分析中。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有检测解决现有MicroRNA检测方法操作繁杂，特异性差，成本高的缺点，而提供一种MicroRNA捕获磁珠、制备方法及MicroRNA的检测方法，该方法省略了多次清洗分离的过程，检测反应可一步完成，且不需要酶的参与，具有操作简便，成本低，灵敏度高等特点。

本发明首先提供一种MicroRNA捕获磁珠的制备方法，该方法包括：

步骤一：将链霉亲和素生物磁珠和生物素修饰的与待测hsa-miRNA-146b-5p完全互补的ssDNA探针混合，得到MicroRNA捕获磁珠；

步骤二：将荧光基团FAM修饰的与ssDNA探针部分互补的荧光DNA和MicroRNA捕获磁珠混合杂交，制备得到荧光MicroRNA捕获磁珠，并在ssDNA探针末端形成一段暴露的Toehold区域；

步骤三：将含有hsa-miRNA-146b-5p的待测液与荧光MicroRNA捕获磁珠混合，进行链置换反应，得到置换后的MicroRNA捕获磁珠。

优选的是，所述的步骤一中生物素修饰的与待测hsa-miRNA-146b-5p完全互补的ssDNA探针的浓度为1nM。

优选的是，所述的步骤一中的ssDNA探针为5’端生物素修饰的ssDNA探针。

优选的是，所述步骤二中的杂交是在设定温度为30℃，140转/分钟的摇床上进行反应，反应时间为1个小时。

优选的是，所述的步骤二中的ssDNA探针末端形成一段暴露的Toehold区域为ssDNA探针和荧光基团FAM修饰的与ssDNA探针部分互补的荧光DNA杂交后在5’末端形成的6个碱基长度的无互补配对空缺区域。

优选的是，所述的步骤二中荧光基团FAM修饰的与ssDNA探针部分互补的荧光DNA的浓度为1μM。

优选的是，所述的步骤三链置换反应是在37℃，170转/分钟的摇床上进行链置换反应1小时。

本发明还提供上述制备方法得到的MicroRNA捕获磁珠。

本发明还提供基于MicroRNA捕获磁珠的MicroRNA的检测方法，该方法包括：