[发明专利]一种毕赤酵母UGGT1的多克隆抗体

说明书

本发明公开了一种毕赤酵母UGGT1的多克隆抗体。本发明将毕赤酵母UGGT1基因片段克隆至大肠杆菌中，经过IPTG诱导表达，得到毕赤酵母UGGT1重组蛋白，以该重组蛋白为抗原，进行动物免疫，获得含有UGGT1抗体的抗血清，该抗血清能够特异性的与酵母中的UGGT1蛋白结合。本发明提供的抗体可以应用于定性或定量测定毕赤酵母的UGGT1蛋白。本发明制备的抗体效价高，专一性强，支持ELISA、Western‑blot等多种类型的实验操作。

技术领域

本发明属于基因工程抗体技术领域，具体涉及一种毕赤酵母UGGT1的多克隆抗体。

背景技术

UGGT1定位于真核生物的内质网（Endoplasmic reticulum，ER），是目前发现的唯一能够识别糖蛋白折叠状态的元件，在真核生物的糖蛋白质量监控系统中发挥核心作用。由于其重要的生物学功能，UGGT1一直是真核生物糖蛋白合成、转运、代谢等研究领域的热点。近年来，随着免疫生物技术的发展，ELISA、 Western-blot、Co-IP、IF等已成为蛋白质研究的常规方法，不同物种来源的UGGT1抗体也应运而生，但由于这些抗体的抗原UGGT1的氨基酸序列差异较大，不同物种来源的UGGT1抗体并不能通用。目前，商品化的UGGT1抗体主要是以动物和植物的UGGT1为抗原制备的，而可以结合酵母UGGT1的抗体仍处于市场空白，也未见有相关的文献报道。

毕赤酵母是重要的工业微生物，广泛应用于食品、医药、饲料等领域的外源蛋白生产。其作为外源蛋白表达宿主，具有真核生物特有的翻译后修饰功能、可以用廉价的无机盐作为培养基进行高密度发酵、细胞本身对人畜无毒害作用等诸多优点。但毕赤酵母作为重组蛋白表达系统，仍有一些瓶颈问题有待突破，例如不同的外源蛋白表达量差异巨大，一些蛋白的表达量可以达到每升发酵液克级以上，而有些蛋白的表达量却低至微克级甚至无法检测到；另外，毕赤酵母表达糖蛋白时，也容易发生过度糖基化，导致重组糖蛋白的功能和性质发生改变，这些问题都源于目前对毕赤酵母细胞内蛋白质的合成和代谢机制的研究还不够透彻和全面。

另外，毕赤酵母也是重要的真核模式生物，它是具有真核生物特征的单细胞生物，是研究其他高等真核生物的优良材料。其糖蛋白质代谢途径的详细解析，不仅有利于解决上述其作为工业微生物遇到的问题，也有利于阐释其他高等真核生物的糖蛋白质合成和代谢机制。

在真核生物中，大多数蛋白质需要经过翻译后修饰，如N-糖基化，O-糖基化、乙酰化以及形成二硫键等，才能发挥特定的生物学功能。其中N-糖基化是最普遍，也是最重要的翻译后修饰方式之一。大量研究表明，N-糖基化对蛋白质的生物活性、热稳定性、信号识别以及胞外释放等均有显著的影响。在各种真核细胞中，蛋白质的糖基化有一套完整且保守的分子机制，这一过程主要包括（1）新合成的多肽进入ER后，寡糖链Glc3Man9GlcNAc2在Oligosaccharide transferase（OST）的作用下，特异性的结合到新合成多肽的N-糖基化结合位点（Asn-Xxx-Ser/Thr，Xxx不能为Pro）的Asn上，（2）糖蛋白所结合的寡糖分子的末端三个葡糖糖会在葡萄糖苷酶Ⅰ和葡萄糖苷酶Ⅱ的作用下被依次迅速切掉，内质网膜定位分子伴侣Calnexin（CNX）或可溶性分子伴侣Calreticulin（CRT）会特异性的与寡糖末端只带有1个葡萄糖的糖蛋白可逆的相互作用，同时在其它分子伴侣（如二硫键异构酶ERp57、肽基脯氨酰异构酶CypB等）的帮助下进行蛋白折叠，（3）如果此时糖蛋白能够顺利完成正确折叠，它将被转运出ER，进入后续的加工步骤，最终被运输到特定的细胞器或被分泌到胞外；如果糖蛋白不能完成正确折叠，位于ER中的UGGT1将识别错折叠糖蛋白，并重新在寡糖链上加上1分子葡萄糖，形成GlcMan9GlcNAc2，并重新被分子伴侣CNX/CRT 识别，形成CNX/CRT循环。在循环过程中，始终无法形成正确折叠的蛋白质最终将进入降解途径。这一过程也被称作ER相关的糖蛋白质量监控系统。在上述糖蛋白的加工过程中，UGGT1是唯一能够识别糖蛋白折叠状态的元件，是该过程的核心和限速元件。由于UGGT1的关键作用，有关UGGT1的研究始终是真核生物蛋白质糖基化研究领域的热点。